青年科学工作者论坛2010年第1期

复配式粗杂粮对大鼠胰岛素抵抗及PPARγ表达的影响

丁舟波，王晓飞，翟成凯*，金鑫，张群，郭延波

（东南大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，南京210009）

摘要：目的 掌握复配式粗杂粮对高脂饮食诱导的大鼠胰岛素抵抗的影响。 方法 40只SD大鼠随机分为阴性对照组(n=10)和高脂造模组(n=30)，分别给予基础饲料和高脂饲料，6周后再将高脂造模组分为高脂模型对照组、米面组、粗杂粮组(n=10)，提供相应饲料。继续喂养9周后，测定大鼠血糖和胰岛素水平，RT-PCR法测定脂肪组织中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ) mRNA表达。结果 6周高脂饮食后，高脂造模组胰岛素指数(HOMA-IR)明显升高，造模成功。粗杂粮组大鼠的体重和HOMA-IR显著低于高脂模型对照组和米面组，粗杂粮组PPARγ mRNA的表达与其他三组比较明显增加（P<0.05）。 结论 复配式粗杂粮能显著降低高脂饮食引起的胰岛素抵抗大鼠的血糖、胰岛素水平，改善胰岛素敏感性，其机制可能与增加PPARγ的表达有关。

【关键词】复配式粗杂粮；胰岛素抵抗；过氧化物酶体增殖物激活受体-γ

Effect of compound coarse grain food on insulin resistance and expression of PPARγ in rat

Ding Zhou-bo, Zhai Cheng-kai, Wang Xiao-fei, Jin Xin, Zhang Qun, Guo Yan-bo

(School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009)

Abstract:  Objective To explore the effect of compound coarse grain food on insulin resistance (IR) in rats. Methods Forty Sprague-Dawlay rats were randomly divided into normal control group (n=10) and model group (n=30), provided regular diet and high fat diet separately. After 6 weeks, the model group were divided into high fat diet group, rice flour group and coarse grain group, and provided the corresponding feed. After feeding 9 weeks, the fasting blood glucose, insulin and the expression of PPAR-γ mRNA in rats were measured. Results IR was successfully induced by 6-weeks high fat diet. The body weight and insulin resistance index (HOMA-IR) in coarse grain group were significantly lower than high fat diet group and rice flour group. The

基金项目：国家自然基金项目（30872118），江苏省社会发展项目（BS2006047），江苏省卫生厅科研重大项目（K200606）

作者简介：丁舟波（1983- ），女，硕士研究生，研究方向：营养与慢性病，Email：dingzhoubo@yahoo.com.cn，联系电话：02583272560

*通讯作者：翟成凯，博导，Email：zck@seu.edu.cn

expression of PPAR-γ mRNA in coarse grain group was significantly higher than other three groups (P<0.05). Conclusion The coarse grain food can reduce the concentration of blood glucose and insulin in rat

with insulin resistance induced by high-fat dietary, and improve insulin sensitivity. The possible mechanism is the over-expression of PPAR-γ.

Key words: compound coarse grain food; insulin resistance; PPAR-γ

胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）是指胰岛素的外周靶组织（主要为骨骼肌、肝脏和脂肪组织）对外源性胰岛素的敏感性和/或反应性降低，导致生理剂量的胰岛素产生低于正常的生理效应。如何预防和改善胰岛素抵抗是目前的研究热点。复配式粗杂粮的人群应用结果显示，该食物对血糖影响较小^[1]，动物实验显示，复配式粗杂粮对脂代谢紊乱大鼠的脂代谢有较好的改善作用^[2]，提示复配式粗杂粮有改善胰岛素抵抗的作用。本文观察复配式粗杂粮对胰岛素抵抗大鼠空腹血糖、胰岛素等生化指标的作用，以及对基因PPARγ表达的影响，探讨复配式粗杂粮改善胰岛素抵抗的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品与试剂  小麦、玉米、高粱、小米和黄豆等原料按比例混合，再磨碎成粉（过60目筛）制成复配式粗杂粮面粉；粳米磨成粉，面粉系标准粉，二者按1：1混合成米面粉。胰岛素试剂盒：北京科美东雅生物技术有限公司；葡萄糖试剂盒：南京建成生物工程研究所。PCR所需试剂：南京天为时代科技有限公司；PCR引物：上海生工生物科技服务有限公司；琼脂糖：sigma公司。

1.1.2饲料配方  采用完全配方饲料。其中阴性对照组饲料参照美国营养学会推荐的AIN-93M实验动物合成饲料配方配制而成，在此基础上适当调整蛋白质和蔗糖的比例，增加饱和脂肪酸含量，制成高脂饲料^[3]；同时用粳米粉、面粉和粗杂粮粉代替高脂饲料中蔗糖和淀粉部分，配制成米面组饲料和粗杂粮组饲料。

表1　 四组实验动物饲料配方的构成（每100克)

Table 1 Diet composition of the four groups（per 100g）

组别	阴性对照组	高脂对照组	米面组	粗杂粮组
酪蛋白	23	18.5	18.5	18.5
玉米淀粉	29.5	27.3	0	0
蔗糖	31	28	0	0
纤维素	5	5	5	5
豆油	7	0	0	0
猪油	0	10	10	10
蛋黄粉	0	5	5	5
胆固醇	0	1.5	1.5	1.5
胆盐	0	0.2	0.2	0.2
混合矿物盐	3	3	3	3
混合维生素	1	1	1	1
DL-蛋氨酸	0.3	0.3	0.3	0.3
氯化胆碱	0.2	0.2	0.2	0.2
粳米	0	0	27.65	0
面粉（标准粉）	0	0	27.65	0
粗杂粮	0	0	0	55.3
供能（Kcal）	303	339	323	337

注：各组饲料能量差异不超过四组平均值的10％；

阴性对照组供能比：蛋白质4.1%，脂肪20.8%，碳水化合物75.1%；

高脂对照组供能比：蛋白质4.7%，脂肪34.0%，碳水化合物61.3%；

米面组供能比：蛋白质11.0%，脂肪37.3%，碳水化合物51.7%；

粗杂粮组供能比：蛋白质13.0%，脂肪39.5%，碳水化合物47.5%。

1.1.3实验动物  体重200g～220g清洁级近交系雄性Sprague-Dawlay (SD)大鼠40只，购自中国科学院上海实验动物中心，许可证号：SCXK（沪）2003－0003。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及造模  40只SD大鼠按体重随机分成阴性对照组10只，给予阴性对照组饲料，高脂造模组30只，给予高脂饲料。两组大鼠在第6周末禁食12～14小时后断尾采血，测空腹血糖（FBG）和胰岛素（INS），计算胰岛素抵抗（HOMA-IR）水平。高脂造模组按HOMA-IR随机分为高脂对照组、米面组、粗杂粮组，每组10只，分别给予高脂饲料、米面组饲料和粗杂粮组饲料，继续喂养9周。

1.2.2 大鼠空腹血糖和胰岛素的测定  实验第0周末、第6周末和第11周末，各组大鼠在禁食12～14小时后断尾采血，测定空腹血糖（FBG）和胰岛素（INS），进行连续动态观察。第15周末实验结束时，动物颈椎脱臼处死，股动脉取血，测定FBG和INS；迅速分离睾周脂肪和肾周脂肪。

1.2.3 胰岛素抵抗（IR）采用稳态模型评价（HOMA-IR）：IR＝（INS×FBG）/22.5，式中INS为空腹血浆胰岛素浓度，FBG为空腹血糖。

1.2.4 脂肪组织中PPARγ mRNA表达的测定  （1）脂肪组织总RNA提取：按总RNA 提取试剂盒的操作步骤进行操作。

（2）引物的设计：大鼠PPARγ和β-actin（内参照）引物设计参照GeneBank中大鼠目的基因序列自行设计。

PPARγ  Forward：5’-TCC GTG ATG GAA GAC CAC TC-3’

Reverse：5’-CCC TTG CAT CCT TCA CAA GC-3’              332bp

β-actin  Forward：5’- TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT A-3’

Reverse：5’- CAT CGG AAC CGC TCA TTG CCG ATAG-3’      295bp

（3）RT-PCR：逆转录反应体系包括：提取的总RNA4μl，5×反应缓冲液4μl，dNTP (10 mmol/L)1μl，Oligo (dT) 1μl，RNA酶抑制剂1μl，逆转录酶1μl，其余用无RNA酶水补充至20μl。反应条件为：30℃10min，42℃60min，99℃5min，4℃5min。PCR反应体系包括：逆转录产物1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Taq DNA 聚合酶12.5μl，其余用无RNA酶水补充至25μl。PCR扩增条件：β-actin为95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；PPARγ为95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。PCR产物经2 %琼脂糖凝胶电泳，并与DNA 标准分子比较鉴定之后，在数字成相仪上照相，扫描分析。

1.2.5 数据处理  数据以±s表示，SAS 8.0统计软件分析数据，采用one-way ANOVA 进行显著性检验，组间比较采用SNK检验，差异显著性设定为P＜0.05。

2 结果

2.1 复配式粗杂粮对大鼠体重的影响

第1周至第6周为造模期。第6周末，高脂模型对照组、米面组和粗杂粮组大鼠体重显著高于阴性对照组（P＜0.05）。第7周至第15周末进行干预。至实验结束，粗杂粮组大鼠的体重显著低于高脂模型对照组和米面组（P＜0.05），与阴性对照组相比体重无显著差异（P>0.05）。详见表2。

表2  各组间大鼠体重的比较 (g, ±S, n=10)

Table 2 The comparison of body weight of rats in four groups(g, ±S, n=10)

注：（1）与阴性对照组相比P＜0.05； （2） 与高脂模型对照组相比P＜0.05；（3） 与米面组相比P＜0.05

2.2 复配式粗杂粮对大鼠FBG、INS和HOMA-IR的影响

实验第6周末即造模结束时，四组大鼠的FBG未见差异（P＞0.05），但是用来造模的三组大鼠（高脂模型组、米面组和粗杂粮组）的INS水平明显高于阴性对照组（P＜0.05）。第15周末，粗杂粮组和米面组大鼠的FBG水平与阴性对照组相比，差异无统计学意义，只有高脂模型组的FBG水平显著高于阴性对照组（P＜0.05）；粗杂粮组大鼠的INS水平明显低于高脂模型组和米面组（P＜0.05），接近阴性对照组。详见表3。

表3  各组间大鼠空腹血糖(FBG)和血清胰岛素(INS)的比较 (±S, n=10)

Table 3 The comparison of fasting blood glucose(FBG) and insulin(INS) of rats in four groups(±S, n=10)

注：（1）与阴性对照组相比P＜0.05；（2）与高脂模型对照组相比P＜0.05；（3）与米面组相比P＜0.05

根据大鼠的FBG和INS计算HOMA-IR。实验前，各组大鼠的HOMA-IR水平无显著性差异（P＞0.05）。实验第6周末，用来造模的三组大鼠HOMA-IR显著高于阴性对照组（P＜0.05），表明经6周高脂饲料喂养，胰岛素抵抗大鼠造模成功。第15周末，粗杂粮组HOMA-IR水平显著低于高脂模型对照组和米面组（P＜0.05），与阴性对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。而米面组HOMA-IR显著低于高脂模型对照组（P＜0.05）但要高于阴性对照组。表明粗杂粮改善胰岛素抵抗的效果要优于米面。详见图1。

图1 大鼠血清HOMA-IR动态变化

Figure 1 The dynamic change of HOMA-IR of rats in four groups

2.3 复配式粗杂粮对大鼠脂肪组织PPARγ mRNA表达的影响

粗杂粮组PPARγ mRNA的表达与其他三组比较明显增加（P＜0.05）。与阴性对照组比较，高脂模型对照组PPARγ mRNA表达明显增加（P＜0.05）。米面组PPARγ mRNA的表达明显高于阴性对照组和高脂模型对照组（P＜0.05）。详见图2和图3。

注：H-高脂模型对照组，C-粗杂粮组，R-米面组，N-阴性对照组，M-DNA marker

图2  各组间大鼠脂肪组织PPAR-γ mRNA表达的比较

3 讨论

过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR）属于细胞内核受体超家族成员，存在3种亚型，包括PPARα、PPARβ和PPARγ。PPARγ的表达具有组织特异性，在鼠中PPARγ主要在贮存脂肪的白色和棕色脂肪组织中表达。

本研究发现，只给予高脂饲料的高脂模型对照组大鼠脂肪组织PPARγ mRNA的表达水平要明显高于只给予基础饲料的阴性对照组大鼠，这与国内外相关研究结果一致^[4,5]，高脂模型对照组PPARγ表达增加的原因可能与高脂饮食使体内脂肪酸含量增高有关，因为脂肪酸可轻度上调PPARγ的表达^[6]。粗杂粮组大鼠的胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）显著低于其他三组，而PPARγ的表达要高于其他组，表明粗杂粮能改善大鼠的胰岛素抵抗，并且提示粗杂粮改善胰岛素抵抗的机制之一可能是通过上调PPARγ的表达来实现的。近年来研究发现PPARγ可直接加强脂肪细胞胰岛素受体后的信号转导过程，从而增强脂肪细胞对胰岛素的敏感性^[7]。粗杂粮使发生胰岛素抵抗大鼠的体重下降，改善了大鼠的肥胖程度。而肥胖与胰岛素抵抗是密切相关的，是代谢综合征、2型糖尿病、心血管疾病、癌症等疾病的强危险因素，脂肪组织分泌的细胞因子例如TNF-α、IL-1等更是在胰岛素抵抗的发生发展过程中扮演了重要角色。PPARγ活化后能够调节脂肪组织中细胞因子的生成，包括TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、TGF-β等，从而抑制脂肪生成，改善胰岛素抵抗^[8,9]。

目前对预防和治疗胰岛素抵抗的研究多集中在降压药、降血脂药、中成药等药物治疗方面^[10,11,12]，尚未发现粗杂粮食品对胰岛素抵抗改善作用的报道。本文发现，复配式粗杂粮食品具有良好的改善胰岛素抵抗的作用，为预防和治疗胰岛素抵抗提供了经济方便的饮食治疗的物质基础。

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