孙长颢 周晓蓉 王舒然 刘 荣 哈尔滨医科大学公共卫生学院,营养与食品卫生学教研室，哈尔滨 １５００８６
摘 要 目的 通过研究共轭亚油酸ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ，ＣＬＡ对饮食诱导肥胖大鼠解偶联蛋白２（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＵＣＰ２）基因表达的影响，探讨ＣＬＡ降低体重、体脂作用的机制。方法 选用雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，随机分为对照组、高脂组、高脂＋ＣＬＡ组（每１００ｇ饲料含ＣＬＡ分别为０．７５ｇ、１．５０ｇ、３．００ｇ），每组动物１０只，观察ＣＬＡ对肥胖大鼠体重、体脂、血脂水平的影响，并应用ＲＴ－ＰＣＲ的方法检测ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表达水平。结果 ＣＬＡ可降低饮食诱导肥胖大鼠的体重和体脂含量，降低血清甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸水平，并可增加肥胖大鼠脂肪组织ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表达水平。结论 ＣＬＡ可改善肥胖大鼠的脂代谢紊乱，增加ＵＣＰ２基因的表达，发挥降低体重、体脂的作用。
关键词 共轭亚油酸；解偶联蛋白２；肥胖；脂代谢紊乱
Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＵＣＰ２ ｉｎ ｏｂｅｓｅ ｒａｔ ｆｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ ＳＵＮ Ｃｈａｎｇｈａｏ ＺＨＯＵ Ｘｉａｏｒｏｎｇ ＷＡＮＧ Ｓｈｕｒａｎ ＬＩＵ Ｒｏｎｇ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｈａｒｂｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨａｒｂｉｎ １５００８６ Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄＣＬＡ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＵＣＰ２） ｉｎ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｏｂｅｓｅ ｒａｔｓ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｏｂｅｓｅｓ ｒａｔｓ ｂｙ ＣＬＡ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｌｅ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｆａｔ ＋ ＣＬＡ ｇｒｏｕｐ０．７５ｇ、１．５０ｇ、３．００ｇ％ ｂｙ ｄｉｅｔ ｗｅｉｇｈｔ． Ｗｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｌｉｐｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ＲＴＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＵＣＰ２． Ｒｅｓｕｌｔｓ ＣＬＡ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｒｕｍ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ ｉｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｏｂｅｓｅ ｒａｔ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＣＬＡ ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｄｙｓｌｉｐｉｄａｅｍｉａ ｏｆ ｏｂｅｓｅ ｒａｔ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｗｅｉｇｈｔ ｂｏｄｙ ａｎｄ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｂｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ；ＵＣＰ２ ；ｏｂｅｓｅｓ；ｄｙｓｌｉｐｉｄａｅｍｉａ 肥胖一种慢性能量平衡失调症，已成为威胁人类健康的主要疾病，寻找肥胖的发病机理及防治措施的研究一直是国内外研究的热点之一。解偶联蛋白ＵＣＰｓ是线粒体内膜上的一种转运蛋白，它能够降低线粒体内膜上的质子梯度，使底物氧化和ＡＤＰ磷酸化解偶联，减少ＡＴＰ的产生，使物质氧化后产生的能量以热量的形式散发出去，因而它与能量代谢密切相关，目前已经将ＵＣＰｓ列为肥胖的候选基因。ＣＬＡ是一种膳食性脂肪酸，主要含有ｃ９ｔ１１ 和ｔ１０ｃ１２两种同分异构体，后者具有降低体重作用，但其作用机制尚不清楚。本文将通过观察ＣＬＡ对饮食诱导肥胖大鼠脂肪组织ＵＣＰ２基因的影响，探讨ＣＬＡ的降低体重的作用机制，从而对肥胖症的预防和治疗提供更大的帮助。
１ 材料与方法
１．１ 材料
（１）共轭亚油酸：购于中国青岛澳海生物有限公司，其中ｃ９ｔ１１含量为３８．１７％，ｔ１０ｃ１２含量为４２．２５％。
（２）试剂盒：①血脂测定试剂盒：购于北京中生生物有限公司。②游离脂肪酸试剂盒：德国Ｒｏｃｈｅ 公司。
１．２ 方法
１实验动物：８０～１００ｇ雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠购于上海医学院实验动物中心，观察１周后，按体重将动物随机分为５组，每组１０只，即基础对照组、高脂组、ＣＬＡ高、中、低剂量组每１００ｇ饲料中含ＣＬＡ分别为３．００ｇ、１．５０ｇ、０．７５ｇ，每周称重１次，记录给食量和撒食量。于第１２周末乙醚麻醉处死动物（处死前１２ｈ空腹），腹主动脉采血，检测游离脂肪酸、血糖、胰岛素，取睾周和肾周脂肪称重记录，并留取睾周脂肪迅速放入液氮中冷冻以备检测ｍＲＮＡ。
２饲料配方：参照ＡＯＡＣ配方和实验大鼠合成饲料配方ＡＩＮ９３，选用纯合成饲料，其所含营养素和能量能保证大鼠生长发育的基本要求，在此基础上调整脂肪、淀粉含量就配成高脂饲料，并根据要求调整ＣＬＡ含量，饲料成分见表１。
３检测指标 ①脂体比的计算：脂体比＝睾周脂肪重量（ｇ）＋肾周脂肪重量（ｇ）体重（ｇ）×１００。② 血脂测定：按试剂盒说明进行。
１．３ ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ测定
按ＧＩＢＣＯ公司总ＲＮＡ提取试剂盒的操作步骤，从１００ｍｇ大鼠白色脂肪组织中提取总ＲＮＡ，逆转录反应以总ＲＮＡ２μｇ为模板，ＵＣＰ２和βａｃｔｉｎ基因采用ｏｌｉｇｏＤＴ为逆转录引物，加入逆转录酶ＡＭＶ１０Ｕ，总反应体系为２０μｌ，４２℃水浴２ｈ，合成第一条ｃＤＮＡ链，ＰＣＲ反应以逆转录产物２μｌ为模板，引物序列见表２，加入引物２０ｐｍｏｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．３５μｌ，总反应体系为２５μｌ，ＰＣＲ扩增条件为：βａｃｔｉｎ为９４℃变性３０ｓ、５７℃退火３０ｓ、７２℃延伸４０ｓ ３０个循环；ＵＣＰ２为９４℃变性３０ｓ、５８℃退火４０ｓ、７２℃延伸４０ｓ，３５个循环。ＰＣＲ产物经２％琼脂糖凝胶电泳，并与ＤＮＡ标准分子比较鉴定之后，在数字成相仪上照相，扫描分析。
１．４ 结果分析
运用ＳＡＳ６．１２软件包，数据以均数±标准差（Ｘ±ｓ）来描述，组间差异采用方差分析进行处理。
２ 结果
２．１ ＣＬＡ对大鼠体重及脂体比的影响（表３）
由表３可见，各组大鼠初始体重无显著性差异，基础组终末体重、脂体比低于高脂组；ＣＬＡ组大鼠随剂量增加，体重和脂体比逐渐下降，各剂量组与高脂组比差异均有显著性（Ｐ＜０．０５）。
２．２ ＣＬＡ对大鼠血脂水平的影响（表４）
由表４可见，与基础对照组比较，高脂组大鼠血清甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸水平明显增高（Ｐ＜０．０５），表明高脂饮食诱导的肥胖大鼠出现了脂代谢紊乱。而ＣＬＡ组大鼠血清甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸水平与高脂组相比明显下降，且有剂量反应关系（Ｐ＜０．０５），表明ＣＬＡ具有改善脂代谢紊乱的作用。
２．３ ＣＬＡ对大鼠脂肪组织ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ基因表达的影响（图１，２）
由图１、２可见，高脂组大鼠脂肪组织ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表达略高于基础组，而ＣＬＡ各剂量组ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表达均高于高脂组，且随着剂量升高，其表达也逐渐增强。
３ 讨论
目前已发现的ＵＣＰｓ有５种，其中ＵＣＰ２表达的范围较广，在人体代谢率方面有重要的作用，所以认为它与肥胖的关系最为密切。Ｏｂｅｒｋｏｆｌｅｒ等２通过比较肥胖者与正常对照者腹膜脂肪组织ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表达水平发现，肥胖者腹膜脂肪组织ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ表达减弱，Ｅｍｉｌｓｓｏｎ等３发现，肥胖大鼠的棕色脂肪组织、白色脂肪组织和骨骼肌ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表达水平比非肥胖鼠下降１３、１２，以上研究提示ＵＣＰ２表达降低可能使能量消耗减少而导致肥胖。
本研究结果显示，试验结束时高脂饮食组大鼠体重、脂体比明显高于基础组Ｐ＜０．０５；与基础组相比，高脂组甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸水平升高，高密度脂蛋白胆固醇明显降低，Ｐ＜０．０５。说明高脂饮食诱导大鼠出现了肥胖和脂代谢紊乱。而ＣＬＡ各组大鼠体重、体脂含量、甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸水平显著低于高脂组，且有剂量－反应关系，表明ＣＬＡ具有降低体重、体脂含量，改善脂代谢紊乱的作用。
为探讨ＣＬＡ降低体重的作用机制，本实验检测了大鼠白色脂肪组织ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表达情况。结果显示，高脂组大鼠脂肪组织ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表达较基础组略高，肥胖大鼠脂肪组织ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ表达增加也许是机体防止能量过剩的代偿反应，而ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ表达的相对不足可能是肥胖发生的原因之一。肥胖时解偶联蛋白不下降甚至升高，提示可能因能量摄入过多，超过了解偶联蛋白的代偿能力。而ＣＬＡ各组大鼠脂肪组织ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ表达较高脂组升高，且有剂量反应关系，说明ＣＬＡ可通过增加ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ的表达，发挥降低体重作用。据报道，ＵＣＰ２受核受体ＰＰＡＲγ的调控，ＰＰＡＲγ可增加ＵＣＰ２的表达４。而本实验室的其它研究还表明ＣＬＡ可激活ＰＰＡＲγ５。因此推测ＣＬＡ可能通过激活ＰＰＡＲγ上调ＵＣＰ２基因的表达，增加能量消耗，降低动物体重。肥胖可引起胰岛素抵抗，是２型糖尿病的主要危险因素。ＣＬＡ可使体重降低，无疑对改善胰岛素抵抗，预防糖尿病的发生具有重要意义。
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