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李 颖综述 孙长颢审校哈尔滨医科大学公共卫生学院；营养与食品卫生教研室，哈尔滨 １５００８６
随着分子生物学技术发展，钙离子对基因表达调控研究得到不断扩展。由于细胞内钙离子（Ｃａｉ２＋）参与众多基因的表达调控而倍受关注，从细胞内钙信号产生，Ｃａｉ２＋与钙调素（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）等结合，Ｃａ２＋．ＣａＭ依赖性蛋白激酶介导的磷酸化级联反应，以及转录因子与ＤＮＡ反应元件的相互作用等过程已被阐明。人们早已发现与外界环境密切相关的细胞外钙（Ｃａｏ２＋）水平变化，可直接调控某些基因表达。１９９３年Ｂｒｏｗｎ 等发现细胞外钙敏感受体（ＣａＲ）基因，填补了细胞外钙调节基因表达的重要空缺。Ｃａｏ２＋可以作为第一信使，通过ＣａＲ与Ｇ蛋白偶联，将细胞外信息传入胞内，使细胞内Ｃａｉ２＋ 升高，磷脂酶Ｃ（ＰＬＣ）活性增强或ｃＡＭＰ水平下降，进而调控基因表达。
１ ＣａＲ的结构和功能
ＣａＲ包含一个６００个氨基酸的ＮＨ２末端细胞外区域（ＥＣＤ）；一个由２５０个氨基酸组成的７个跨膜区域（ＴＭＤ）的核心区域，该区域是Ｇ蛋白偶联受体ＧＰＣＲ超级家族的特征；和一个大的２００个氨基酸的细胞内ＣＯＯＨ末端尾。该受体的ＥＣＤ含有多个Ｎ糖基化位点，它的细胞内区域由３个细胞内环（ＩＣＬ）和ＣＯＯＨ尾组成，包含有几个蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）和蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）磷酸化位点的共有序列，而且ＰＫＡ位点存在于目前为止所研究的所有物种中（除牛ＣａＲ外）。已发现ＰＫＣ磷酸化位点可调节受体活性，而ＰＫＡ位点生理作用还不清楚（见图１）。
２ ＣａＲ介导的信号传导通路
ＣａＲ作为ＧＰＣＲ家族的成员，通过与Ｇ蛋白偶联将细胞外信号传入细胞内。ＣａＲ与配体（Ｃａｏ２＋）结合后即与膜上的偶联蛋白结合，使其释放活性因子，再与效应器发生反应。
稳定表达ＣａＲ的ＨＥＫ２９３细胞可激活磷脂酶Ｃ、Ａ２、Ｄ，而不表达ＣａＲ的ＨＥＫ２９３细胞中，ＣａＲ激动剂对这些磷脂酶没有作用。牛甲状旁腺细胞中，ＣａＲ激动剂能刺激这３种磷脂酶，推测是通过ＣａＲ激活的。甲状旁腺中，ＣａＲ介导ＰＩＰＬＣ的激活，可能由Ｇｑ１１参与的Ｇ蛋白介导过程，因此该作用不会被百日咳毒素阻断。然而ＡｔＴ２０细胞中，ＣａＲ介导ＰＩＰＬＣ激活受预处理的百日咳毒素所抑制。因此，ＣａＲ可能利用不同的信号途径，包括百日咳毒素敏感性或百日咳毒素不敏感性Ｇ蛋白，激活ＰＩＰＬＣ信号系统，使细胞内钙水平升高，从而产生细胞反应或调解基因表达。
ＣａＲ稳定转染的甲状旁腺细胞和ＨＥＫ２９３细胞中，高Ｃａｏ２＋可抑制ｃＡＭＰ生成，提示可能是由Ｇｉ直接介导腺苷酸环化酶的抑制作用。该抑制作用同样存在于小鼠髓袢升支粗段，然而，最近对大鼠肾脏的髓袢升支粗段研究表明，高Ｃａｏ２＋诱导的ｃＡＭＰ抑制作用，是由花生四烯酸参与的间接百日咳毒素敏感性作用机制。这可能通过Ｃａｏ２＋诱导ＣａＲ刺激ＰＬＡ２活性增加，从而抑制ｃＡＭＰ的生成来实现的。
３ Ｃａｏ２＋对甲状旁腺激素基因的转录调节
３．１ 甲状旁腺激素基因结构与功能
研究表明Ｃａｏ２＋可通过负向基因调节机制调控甲状旁腺激素（ＰＴＨ）基因表达。人的ＰＴＨ（ｈＰＴＨ）基因含有２个内含子，３个外显子。外显子１编码５非编码区，外显子２编码前导肽，外显子３编码激素原、切割位点、ＰＴＨ序列和３非编码区。ｈＰＴＨ基因有２个顺式负向转录元件（ｏｌｉｇｏＡ和ｏｌｉｇｏＢ），存在于启动子上游的－２．４ｋｂｐ～－３．６ｋｂｐ之间。这两个元件以序列特异性方式与转录因子结合，从而抑制ｈＰＴＨ基因的转录。ｏｌｉｇｏＡ以双向行使功能，而ｏｌｉｇｏＢ仅以原有的方向行使功能，它们都距离转录起始点很远，因此具有沉默子特征。ｈＰＴＨ基因的这两个顺式负向转录元件被称为负向Ｃａ２＋反应元件（ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃａ２＋ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｎＣａＲＥ）。ｏｌｉｇｏＢ包含一个回文序列ＴＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡ，此序列可与二聚体的核蛋白相结合。
３．２ 参与Ｃａｏ２＋调节ＰＴＨ基因的转录因子
研究表明，氧化还原因子蛋白１（ｒｅｆ１）以序列特异性和Ｃａｏ２＋浓度依赖性方式与ｎＣａＲＥ（ｏｌｉｇｏＡ和ｏｌｉｇｏＢ）结合，从而起到负向调节ＰＴＨ基因表达的转录因子的作用。人类ｒｅｆ１ ｃＤＮＡ编码３１８个氨基酸，存在于细胞核中，属于该信号的核受体成员之一。另外ｒｅｆ１还可通过改变几个转录因子如ＡＰ１、Ｍｙｂ和ＮＦкＢ的氧化状态，增强它们与ＤＮＡ 结合活性。
最近研究表明，ｃＡＭＰ应答元件结合蛋白ＣＲＥＢ和它的同系物ｐ３００具有辅助激活因子作用，ＣＢＰｐ３００本身并不与ＤＮＡ结合，而是通过与序列特异性转录因子（ＴＦ），如ｒｅｆ１、ｐ５３、核受体进行结合，作用于ＤＮＡ。ＣＢＰｐ３００是通过乙酰化核小体的组蛋白使染色质解聚来激活转录。不仅如此，它也可乙酰化ＴＦ，因此被称为因子乙酰化转移酶。Ｃａｏ２＋可激活转录协同子ｐ３００，活化的ｐ３００使ｒｅｆ１的Ｌｙｓ６或Ｌｙｓ７位点发生乙酰化，从而增强ｒｅｆ１与ｎＣａＲＥ的结合活性，起到ＰＴＨ启动子阻遏物的作用。体内研究表明，ｒｅｆ１同Ⅰ型组蛋白脱乙酰基酶稳定地相互作用。乙酰化ｒｅｆ１可增强ｒｅｆ１与Ⅰ型组蛋白脱乙酰基酶形成复合物，从而增强与ＰＴＨ启动子的结合活性，表明乙酰化ｒｅｆ１在转录调节中起重要作用。
研究发现，ｒｅｆ１与ｎＣａＲＥｓ结合还需要Ｋｕ抗原ＫｕＡｇ的参与，ｒｅｆ１和ＫｕＡｇ共同作用于ｎＣａＲＥｓ起到ｎＣａＲＥＢ的作用。ＫｕＡｇ含ｐ７０和ｐ８０两个亚基，在ＤＮＡ双链断裂修复中起重要作用。研究表明，ＫｕＡｇ的ｐ７０亚基的亮氨酸拉链（残基３９５３９９）具有共有序列ＡＡ ＫＥＲＣＲ，该序列可与ｒｅｆ１相互作用，提示ＫｕＡｇ可能通过该共有序列与ｒｅｆ１结合来发挥重要作用。
总之，升高的Ｃａｏ２＋与甲状旁腺细胞表面的ＣａＲ作用，促进ＣａＲ与Ｇ蛋白偶联，使Ｃａｉ２＋水平升高，激活细胞内钙信号系统，经过一系列级联反应，信号传递入细胞核，使ｐ３００活化，乙酰化的ｒｅｆ１与ＫｕＡｇ作用，最终与ｎＣａＲＥ（ｏｌｉｇｏＡ和ｏｌｉｇｏＢ）结合，抑制ＰＴＨ的转录。
４ Ｃａｏ２＋调节ＨＧａＲＧ基因的转录
动脉高血压的发生与钙代谢紊乱有关，这一现象不仅在人群流行病学研究中得到证实，而且还在高血压动物模型中得到验证。在遗传性或自发性高血压大鼠中，肾脏和小肠存在钙代谢紊乱，表现为尿钙增加，小肠钙吸收下降，血中钙水平降低，而循环中血小板、淋巴细胞和血管平滑肌细胞的细胞质中，钙离子的水平升高。可见，在自发性高血压大鼠及低肾素性高血压患者中，细胞外钙和细胞内钙之间存在负相关。
２０００年Ｓｏｌｂａｎ等从自发性高血压大鼠中克隆了一个新的基因。在自发性高血压大鼠甲状旁腺和其它几个组织中，新基因的ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平显著高于血压正常的对照大鼠，且降低细胞外钙水平导致该基因ｍＲＮＡ水平升高，因此将该基因命名为高血压相关性钙调节基因（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｒｅｌａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ，ＨＧａＲＧ）。该基因由１１００个碱基对组成，含有一个２２４个密码子的ｃＤＮＡ开放读码框架。主要在心脏、胃、空肠、肾脏、肝脏、和肾上腺中进行表达，与ＣａＲ表达的组织分布相一致，提示ＨＧａＲＧ受Ｃａｏ２＋水平调控，并由ＣａＲ所介导。
研究发现，在缺血性损伤肾脏模型中，上皮细胞增生肥大，细胞分化受到抑制，ＨＣａＲＧ ｍＲＮＡ水平升高。当进行缺血再灌注后，上皮细胞分化活跃，ＨＣａＲＧ ｍＲＮＡ水平迅速下降。综合上述研究结果，ＨＣａＲＧ可能在控制肾脏上皮细胞生长和分化中起重要作用，然而其分子机制还不清楚。心房利钠利尿素具有很强的利钠和利尿的功能，可使血压显著降低。当ＨＣａＲＧ表达增加时，心房利钠利尿素水平升高，提示ＨＣａＲＧ 可能具有拮抗心房利钠利尿素功能的作用。
ＨＧａＲＧ水平升高同动物遗传性高血压相一致，而且降低细胞外钙水平会使其转录和表达水平升高，提示ＨＧａＲＧ调节异常可能是由于高血压大鼠细胞外钙水平下降，或对细胞外钙水平产生异常反应，使ＨＣａＲＧ表达增高，引发肾脏增生肥大，并对心房利钠利尿素产生拮抗作用，从而导致血压升高。有关ＨｇａＲＧ和高血压的关系有待于进一步的研究。
５ 钙对基因表达调控的意义
钙作为细胞信号传导物质时，一般认为是非营养、非能量的信息过程的一种中介物。实际上，人们最初对钙的认识是它所具有的营养素功能，作为构成机体的结构性元素，儿童钙缺乏会导致佝偻病，对于成人和老年人会产生骨质疏松。钙作为营养素其功能还不仅如此，近年来的流行病学调查发现，膳食钙的摄入还与高血压、肥胖、高血脂和胰岛素抵抗密切相关。自发性高血压大鼠中克隆的ＨｇａＲＧ基因，一方面证实了通过膳食钙调控基因表达，一方面为人们将来防治高血压提供了思路和依据。
这些研究提示，钙作为营养素和具有信号功能的非营养素之间并没有界限。确实随着研究的不断深入，人们发现钙不止作为细胞内的第二信使而起作用，以及在细胞核中直接激发信号的级联反应起到第三信使的功能，而且ＣａＳＲ基因的发现，使人们认识到细胞外钙可调控甲状旁腺激素的分泌，使之具有第一信使的功能。这些发现拓宽了我们对钙生理功能的认识。以往预防医学领域更注重钙作为营养素的功能研究，而起信号传导作用、非营养素功能的钙研究被认为是基础医学范畴。随着学科之间的相互渗透，应运而生一些交叉学科如，分子流行病学、分子营养学，我们相信在这些理论的支持下，及分子生物学技术的发展，终将会揭示钙作为膳食的营养成分，一种外界的刺激，通过怎样的途径调控基因的表达，从而调节血压、体重、胰岛素抵抗这些占人类疾病谱重要位置的慢性疾病的发生，最终达到控制和预防这些疾病的目的。这在预防医学领域乃至整个医学界都将具有重大意义，并将产生深远的影响。这也是作子分子营养学关注钙对基因表达调控机制的意义所在。
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１０． Ａｌｉｓｏｎ Ｍ． Ｄ Ｎｉｃｏｌａｓ Ｓ Ｓａｎｄｒａ Ｔ ＨＣａＲＧ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃａｕｓｉｎｇ Ｇ２Ｍ ａｒｒｅｓｔ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００３ ２８４ Ｆ７５３－Ｆ７６２． | 