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周小建１ 王卫平２ 杨 毅２ １ 上海交通大学附属第一人民医院儿内科，上海 ２０００８０；
摘要：目的 观察视黄酸受体基因在儿童胸腺中的表达与分布，探讨其在儿童免疫系统发育中的意义。 方法 用地高辛素标记的反义ＲＮＡ 探针原位杂交法，测定５岁以下儿童胸腺中视黄酸受体ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ， ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＲＸＲγ ６种亚型基因的表达与分布。同期的连续冰冻切片还用免疫组织化学法测定ＣＤ１ａ、ＣＤ３的表达，分析视黄酸受体基因表达及分布与Ｔ淋巴细胞成熟的关系。并采用实时定量ＲＴＰＣＲ法对基因表达水平进行定量分析。结果 原位杂交结果显示，胸腺皮质及髓质均表达ＲＡＲα、ＲＡＲγｍＲＮＡ 而ＲＸＲα、ＲＸＲβｍＲＮＡ主要在胸腺髓质表达，尤其在哈氏小体外周成熟的胸腺细胞表达较高。胸腺中不表达 ＲＡＲβ、ＲＸＲγ ｍＲＮＡ。实时定量ＲＴ－ＰＣＲ分析结果显示ＲＡＲα、 ＲＸＲαｍＲＮＡ在出生后第１年高表达，１岁后表达下降，但在１～５岁之间变化无显著差异。ＲＡＲγｍＲＮＡ则随年龄增长表达增高，ＲＸＲβｍＲＮＡ在５岁以内变化不明显。结论 视黄酸受体基因在胸腺中的表达随儿童免疫系统的发育而变化，不同受体亚型基因表达水平的调节在Ｔ淋巴细胞的分化发育中可能具有重要意义。
关键词：视黄酸受体；胸腺；淋巴细胞；发育
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｔｈｙｍｕｓ
ＺＨＯＵ Ｘｉａｏ－ｊｉａｎ１，ＹＡＮＧ Ｙｉ２，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ－ｐｉｎｇ２
１Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００８０
２ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３２
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｙｍｕｓ ｇｌａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ２０ ｃｈｉｌｄｒｅｎ，ａｇｅｄ ｆｒｏｍ ３ ｍｏｕｔｈｓ ｔｏ ５ ｙｅａｒｓ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｉｂｏ－ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ，ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＲＸＲγ ｗｅｒｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｌａｂｅｌｅｄ ｗｉｔｈ ＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ． Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ｆｒｏｚｅｎ ｔｈｙｍｕｓ ｓｅｃｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ＣＤ１ａ ａｎｄ ＣＤ３ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｉｎｕｅｏｕｓ ｆｒｏｚｅｎ ｔｈｙｍｕｓ ｓｅｃｔｉｏｎ ｔｏ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＡＲαａｎｄ ＲＡＲγ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｓｅｅｎ ｉｎ ｃｏｒｔｅｘ ａｎｄ ｍｅｄｕｌｌａ ｏｆ ｔｈｙｍｕｓ． Ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ＲＸＲαａｎｄ ＲＸＲβ ｍＲＮＡ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｕｌｌａ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｍｕｓ ｍａｉｎｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｈａｓｓａｌｌ’ｓ ｃｏｒｐｕｓｃｌｅｓ． ＲＡＲβａｎｄ ＲＸＲγｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｙｍｕｓ． Ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴＰＣＲ ａｎａｌｙｓｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＡＲαａｎｄ ＲＸＲαｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ａｔ ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｙｅａｒ ａｆｔｅｒ ｂｉｒｔｈ ｔｈｅｎ ｉｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ａｎｄ ｒｅａｃｈ ａ ｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｓｔａｇｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ １～５ ｙｅａｒｓ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． ＲＡＲγｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ａ ａｇｅｒｅｌａｔｅｄ ｍａｎｎｅｒ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ＲＸＲβ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ｔｈｙｍｕｓ ｉｓ ａｇｅｒｅｌａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｍａｙ ａｓｓｉｓｔ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｈｙｍｕｓ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
类维生素Ａｒｅｔｉｎｏｉｄｓ是一组天然或人工合成的维生素Ａ衍生物的总称。研究表明，维生素Ａ及其活性代谢产物视黄酸ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＲＡ对细胞的增殖、分化、及胚胎的发育具有重要作用１。此外，类维生素Ａ对免疫系统的影响也日益被人们所关注，实验证明类维生素Ａ对Ｔ、Ｂ淋巴细胞均有作用２，３。Ｗａｎｇ等４研究发现，虽然ＲＡ可显著促进脐血单个核细胞ＩｇＭ的生成，但对成人外周血单个核细胞ＩｇＭ的生成作用不明显，这提示ＲＡ对免疫系统的作用随年龄增长和生长发育而不同，其规律尚未见报道。
类维生素Ａ调控细胞功能的作用是通过其受体实现的。视黄酸受体有两类：ＲＡＲｓｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ和ＲＸＲｓｒｅｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ 均属于甾体激素甲状腺激素核受体超家族。ＲＡＲｓ和ＲＸＲｓ各有３个不同亚型α、β、γ５。ＲＡＲｓ与ＲＸＲｓ形成异源二聚体和同源二聚体后才能有效地与靶基因启动子附近的ＲＡ反应元件ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＲＡＲＥｓ结合，并在辅助调节因子作用下调控靶基因转录６。了解视黄酸受体在发育过程中表达水平的变化，对于阐明类维生素Ａ对免疫功能作用的机制具有重要意义。
本研究通过观察不同年龄儿童胸腺中视黄酸受体基因的表达分布，探讨其与Ｔ细胞发育的关系，为临床合理使用维生素Ａ制剂增强儿童免疫功能提供理论依据。
1 材料和方法
标本来源及制备 ２０例胸腺标本为本院３个月至５岁先天性心脏病儿童在进行心脏修补手术时为暴露术野切除之部分胸腺。按年龄分为５组，每组４例。所有儿童均为单纯房缺或室缺，心功能及营养发育良好，其母怀孕期间无维生素缺乏病史。新鲜胸腺标本立即用ＯＣＴ包埋，置－７０℃冰箱保存。另取约５０ｍｇ组织，采用Ｔｒｉｚｏｌ抽提ＲＮＡ。ＯＣＴ包埋的组织块用恒温冷冻切片机切片，每片厚度为５～７μｍ。
主要试剂 人视黄酸受体ｈＲＡＲα、ｈＲＡＲβ、ｈＲＡＲγｃＤＮＡ探针由复旦大学附属肿瘤医院邵志敏教授惠赠 ｈＲＸＲα、ｈＲＸＲβ、ｈＲＸＲγｃＤＮＡ探针由法国Ｃｈａｍｂｏｎ Ｐ教授惠赠。ＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ购自Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ。Ｔｒｉｚｏｌ及ＭＭＬＶ购自Ｇｉｂｏｌ ＢＲＬ。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｄｙｅ购自Ｒｏｃｈｅ公司。
原位杂交 采用ＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ标记反义ＲＮＡ探针。新鲜组织切片用４％多聚甲醛固定，ＰＢＳ缓冲液含０．１％活性ＤＥＰＣ冲洗２次，５６℃预杂交２ｈ后，每张切片加５０μｌ杂交液包含２０ｎｇ地高辛素标记的反义ＲＮＡ探针，置湿盒中４２℃水浴过夜。再以不同浓度的ＳＳＣ洗片，加抗地高辛抗体１∶５００购自Ｒｏｃｈｅ室温２ｈ，用ＮＢＴ及ＢＣＩＰ染色ＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液终止显色。
免疫组化 纯化的鼠抗人ＣＤ１ａ、ＣＤ３抗体购自ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，羊抗鼠二抗及ＤＡＢ用Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ公司的ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ检测试剂盒。同期的连续冰冻切片用乙醇固定后，常规水化，采用ＡＢＣ法进行免疫组织化学检测，ＤＡＢ染色，阳性结果为棕黄色。并用甲基绿复染细胞核。
逆转录和实时定量PCR 总ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ作为模板进行实时定量ＰＣＲ分析。视黄酸受体基因的引物采用Ｐｒｉｍｅｒ３软件设计，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列及产物片段长度见表１。采用阳性特异性扩增产物经回收纯化和测定ＯＤ２６０值准确定量后，以１０的倍比稀释１０６～１０１０拷贝数５０ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ制备标准曲线。每一样本的拷贝数采用ＦＴＣ２０００荧光定量ＰＣＲ仪提供的分析软件计算获得结果。
统计学分析 多组均值比较采用单因素方差分析再经过Ｓｃｈｅｆｆｅ法进行均数间两两比较，用ＳＰＳＳ１０．０统计软件包进行分析。
2 结果
儿童胸腺组织视黄酸受体mRNA的表达与分布：胸腺组织表达ＲＡＲα图１、ＲＡＲγｍＲＮＡ，不表达ＲＡＲβ、ＲＸＲγｍＲＮＡ。ＲＸＲαｍＲＮＡ表达于髓质胸腺细胞，以及皮质髓质交界部的胸腺细胞，尤以哈氏小体Ｈａｓｓａｌｌ’ｓ ｃｏｒｐｕｓｃｌｅｓ周围明显图２。ＲＸＲβｍＲＮＡ主要表达于髓质胸腺细胞。
免疫组织化学染色结果显示，ＣＤ１ａ主要在皮质胸腺细胞表达图３，而ＣＤ３主要表达于髓质胸腺细胞，及少许皮髓质交界区胸腺细胞图４。
不同年龄儿童视黄酸受体基因在mRNA水平的表达变化 实时定量ＲＴＰＣＲ的结果见表２。从中可以看到ＲＡＲαｍＲＮＡ的表达在１岁以内较高，与其它年龄组相比差异显著Ｐ＜０．０５，１岁以后表达有所下降，但在１～５岁变化无显著性差异Ｐ＞０．０５。ＲＡＲγｍＲＮＡ的表达在３岁以内较低，３岁后增高，～５岁组儿童表达最高Ｐ＜０．０１。ＲＸＲαｍＲＮＡ的表达在生后的１年内较高，２岁后下降Ｐ＜０．０５，此后的几年维持在一定水平，变化无显著性差异Ｐ＞０．０５。而ＲＸＲβｍＲＮＡ的表达在５岁以内无明显的变化Ｐ＞０．０５。胸腺不表达ＲＡＲβｍＲＮＡ、ＲＸＲγｍＲＮＡ，这与原位杂交结果一致。
3 讨论
不同的视黄酸受体表达及相互作用的复杂性是类维生素Ａ功能多样性的分子基础。我们以往的研究证实人外周血淋巴细胞表达ＲＡＲα、ＲＡＲγｍＲＮＡ，并发现ＲＡ对脐血淋巴细胞抗体生成的促进作用是通过ＲＡＲα途径７，８，虽然ＲＡ可显著促进脐血单个核细胞ＩｇＭ的生成，但对成人外周血单个核细胞ＩｇＭ的生成作用不明显，这提示类维生素Ａ对免疫系统的作用可能与年龄有关，因此研究不同年龄儿童胸腺中ＲＡＲｓ与ＲＸＲｓ各亚型基因在ｍＲＮＡ水平的表达分布，了解其与免疫系统发育的关系 有助于阐明视黄酸作用于免疫系统的机制，为防治儿童免疫功能低下提供理论依据。
我们的研究表明人胸腺组织中表达ＲＡＲα、ＲＡＲγ、ＲＸＲα、ＲＸＲβｍＲＮＡ，不表达ＲＡＲβ、ＲＸＲγｍＲＮＡ。结合ＣＤ１ａ与ＣＤ３的表达分布，我们发现ＲＡＲα、ＲＡＲγｍＲＮＡ在未成熟及成熟的胸腺细胞均有表达。有关视黄酸受体基因表达与胸腺细胞发育分化的关系尚不清楚，Ｓｚｏｎｄｙ等９认为视黄酸可以通过ＲＡＲα途径抑制细胞凋亡，而ＲＡＲγ途径则诱导胸腺细胞凋亡，生理条件下ＲＡＲα途径与ＲＡＲγ途径处于相对平衡，通过精确调节ＲＡＲｓ表达导致ＲＡＲαＲＡＲγ表达比率的变化可影响细胞的发育。由于ＲＡＲβ可通过抑制ＡＰ１ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １而介导ＲＡ的抗细胞增殖作用１０，因此在发育过程中该受体表达的丢失可能对细胞的生长、分化具有重要作用。另一方面，由于ＲＸＲｓＲＡＲｓ异二聚体是视黄酸信号的主要功能单位，为此，我们测定了ＲＸＲｓ基因的表达分布，结果表明ＲＸＲα、ＲＸＲβｍＲＮＡ主要表达于胸腺小体周围成熟的胸腺细胞。Ｙａｎｇ１１认为ＲＸＲβ的高表达与抑制Ｔ细胞凋亡有关，这种作用在ＲＡＲ的存在下可明显增强。ＲＸＲα表达的生理意义尚不完全清楚，Ｉｓｈａｑ等１２认为精确调节ＲＸＲα表达可能对Ｔ细胞阳性、阴性选择及细胞免疫应答具有重要的意义。
为了进一步定量分析视黄酸受体基因在ｍＲＮＡ水平的表达与儿童免疫系统发育的关系，我们采用实时定量ＰＣＲ的方法检测了不同年龄阶段儿童胸腺视黄酸受体基因在ｍＲＮＡ水平的表达，结果发现ＲＡＲαｍＲＮＡ在１岁以内的儿童表达较高，１岁以后表达有所下降，但在１～５岁变化无显著性差异。ＲＸＲαｍＲＮＡ表达与ＲＡＲαｍＲＮＡ类似。这种变化可能与不同年龄儿童胸腺的细胞构成有关，研究表明胸腺的细胞构成及激素分泌在生后第一年达到高峰，此后逐渐退化，胸腺组织局部分泌的一些细胞因子及外源性因子可能参与这一过程１３。ＲＡＲγｍＲＮＡ则随年龄增长而表达增高，这与以往动物实验的结果一致，Ｙａｇｉ１４通过对胎鼠胸腺细胞的研究发现，该胸腺细胞表达ＲＡＲαｍＲＮＡ，而不表达ＲＡＲβ、ＲＡＲγｍＲＮＡ，且ＲＡＲαｍＲＮＡ主要表达于ＣＤ４＋ＣＤ８＋双阳性细胞ｄｏｕｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＤＰ 因此ＤＰ细胞可能是ＲＡ的主要靶细胞 而成年鼠胸腺细胞主要表达ＲＡＲα、ＲＡＲγｍＲＮＡ１５。可见不同年龄阶段的胸腺细胞表达视黄酸受体的亚型并不完全一致，视黄酸受体亚型在细胞发育分化中的表达具有一定的时空性，结合视黄酸受体基因在胸腺中的表达分布，我们认为视黄酸受体基因的表达或丢失，通过影响淋巴细胞的分化、成熟从而调控儿童免疫系统的发育。
总之，视黄酸受体基因的表达与儿童免疫系统的发育具有一定的关系，并且参与了淋巴细胞的发育成熟，但确切的机制尚不清楚，因此深入研究视黄酸受体基因表达与淋巴细胞发育分化及功能的关系，将有助于阐明维生素Ａ促进淋巴细胞功能的机制。
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