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ＹｕＮｉ Ｌａｉ ＭＳ ＳｕｎｇＬｉｎｇ Ｙｅｈ ＰｈＤ ＭｉｎｇＴｓａｎ ＬｉｎＭＤ ｅｔ ａｌ 刘艳妮 王 劲译
１ 前言
败血症是临床上常见的大手术病人的术后并发症。败血症时，机体受到细菌毒素侵袭，可能会发生深部组织的破坏和代谢底物的改变。全肠外营养（ｔｏｔａｌ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＴＰＮ）的发展为那些不宜经胃肠道进食的患者提供了摄取足够的热量和蛋白质的途径。然而，有证据显示ＴＰＮ可导致肠萎缩和肠道淋巴组织（ｇｕｔａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ，ＧＡＬＴ）损伤。小肠ＧＡＬＴ为所有的肠粘膜部位提供初级免疫保护。因为粘膜免疫一般由ＧＡＬＴ中的Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑产生，由其处理肠道内抗原物质，并激发产生相应的原初Ｂ细胞和Ｔ细胞，因此Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑受到特别的关注。研究显示当进行ＴＰＮ治疗时Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑内的Ｂ细胞和Ｔ细胞群数量明显减少。而且经静脉营养的动物，其白介素４（ＩＬ４）和白介素１０（ＩＬ１０）及ＩｇＡ水平下降。临床上认为对危重患者，肠内营养途径好于肠外营养补给途径。但同时也发现败血症会减少肠系膜血流量，并对小肠的屏障功能和代谢功能造成不良影响。Ｇａｒｄｉｎｅｒ等认为存在肠源性败血症的情况下，肠外营养较肠内营养更有益于提高大鼠的生存率。
谷氨酰胺（Ｇｌｎ）是人体的半必需氨基酸，且表明其对机体有多种有益的功能。Ｉｎｏｕｅ等对腹膜炎模型的研究发现，静脉输注Ｇｌｎ治疗组的肠重量及肠粘膜上的双糖酶活性均高于对照组。Ｎａｋａ等研究分析了静脉内输注Ｇｌｎ二肽对败血症死亡率的影响，发现给以ＧｌｎＴＰＮ组动物的死亡率显著低于接受常规ＴＰＮ组动物。Ｇｌｎ对机体的有益作用被认为是由于其对增加肠血流量及维持肠屏障功能的保护效应。临床研究也表明Ｇｌｎ治疗组患者罹受的临床感染更少和住院时间更短。一些研究者提出Ｇｌｎ可能对于治疗常规的感染和炎症有用。据我们所知，还没有Ｇｌｎ对感染和败血症后ＧＡＬＴ功能影响的研究。因此，我们研究了在败血症病发前补充Ｇｌｎ膳食和病发后给以富含Ｇｌｎ的ＴＰＮ，或者二者联合使用对Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑功能及其分泌ＩｇＡ的影响。由于应用盲肠结扎和穿刺（ＣＬＰ）复制大鼠的肠源性败血症模型较为简便且更具临床相关性，故在本次研究中，我们应用了ＣＬＰ建立败血症疾病模型。
２ 材料和方法
２．１ 动物
雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重２３０～２５０ｇ，以不锈钢笼饲养于温湿度可控房间，１２ｈ１２ｈ光照／黑暗循环；实验前３ｄ动物自由进食标准大鼠饲料。
本研究中所有程序均遵循国立台湾大学动物管理委员会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）的有关规定。
２．２ 分组及手术步骤
所有大鼠被分为１个对照组和４个实验组。对照组、实验１组和实验２组给以半精制饲料；而实验３组和实验４组给予上述相同饲料，但其中２５％的总氨基酸氮用Ｇｌｎ取代部分酪蛋白（见表１）。在分别给以大鼠上述饲料饲养１０ｄ后，实验组动物的败血症采用ＣＬＰ诱导形成，而对照组动物采用假手术诱导。ＣＬＰ参照Ｗｉｃｈｔｅｒｍａｎ等的方法。即，腹腔注射戊巴比妥（５０ｍｇｋｇ）麻醉大鼠，经腹中线切口打开腹腔。分离盲肠，以３～０丝质绷带覆盖缠绕至恰好低于回盲瓣部后，用１８号针穿刺盲肠两次后将其复位，腹部伤口用两层纱布覆盖。所有动物经ＣＬＰ或假手术后立即插管进行ＴＰＮ。硅导管（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡ）从右颈静脉插入，导管末端穿过皮下到达颈后经螺形弹簧穿出，连在一个旋轴上以利于动物在各自的代谢笼内自由活动。第１天ＴＰＮ速度以２ｍｌｈ进行，此后ＴＰＮ速度以全速进行，灌输速度由Ｔｅｒｕｆｕｓｉｏｎ泵（ｍｏｄｅｌ ＳＴＣ５０３，Ｔｅｒｕｍｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）调控。 无脂肪ＴＰＮ液在层流橱内制备，每日在使用前向ＴＰＮ液内添加灭菌脂肪乳。室温下全天灌输ＴＰＮ液。所有大鼠用ＴＰＮ维持３ｄ，期间不给任何肠内营养。对照组和实验１组、３组给以常规ＴＰＮ，实验２组和４组补充Ｇｌｎ，以Ｇｌｎ提供ＴＰＮ液里２５％的氨基总氮。ＴＰＮ供给２８０ｋｃａｌｋｇ．Ｂｗ，千卡∶氮＝１２０∶１。除氨基酸含量外ＴＰＮ液里含氮量和营养素组成相同（见表２）。本研究共有５组大鼠：对照组，假手术前后均不补充Ｇｌｎ；实验１组，ＣＬＰ前后不补充Ｇｌｎ（－－）；实验２组，ＣＬＰ前饲以半精制饲料，ＣＬＰ后给以含Ｇｌｎ的ＴＰＮ液（－＋）；实验３组，ＣＬＰ前以补充Ｇｌｎ的饲料，术后给以常规ＴＰＮ（＋－）；实验４组，术前以补充Ｇｌｎ的饲料，术后给含Ｇｌｎ的ＴＰＮ液（＋＋）。
２．３ 血浆Ｇｌｎ水平分析
持续ＴＰＮ输液直到动物死亡。所有大鼠麻醉后腹主动脉放血处死。血标本以含肝素试管收集并立即离心分离。血浆在用５％水杨酸去蛋白质后以标准茚三酮方法（Ｍｏｄｅｌ ６３００，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）分析测定血浆氨基酸含量。
２．４ Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑中淋巴细胞的分离
假手术或ＣＬＰ３ｄ后，所有存活大鼠〔对照组（存活数实验前总数）：９９；－－：１１１７；－＋：９１３；＋－：９１４；＋＋：１１１６〕称重后腹腔注射戊巴比妥麻醉。４个实验组的存活大鼠无差别。经腹中线切口，仔细翻动每只大鼠的十二指肠至回肠末端部分，计数小肠上的Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑个数，Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑内淋巴细胞的分离参照文献所述１。 即从小肠浆膜部切离Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑并用１８号针将其挑破，碎片用含５０Ｕｍｌ的Ⅰ型胶原酶（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）并加入１００μｇｍｌ的青霉素和链霉素的ＲＰＭＩ１６４０，３７℃温孵恒温振荡６０ｍｉｎ处理。经胶原酶消化后，悬浮细胞经尼龙膜过滤并用Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐液冲洗３遍。细胞数目校正到２×１０６ｍｌ，并悬浮于含１０％胎牛血清，２ｍＭ的Ｇｌｎ和抗生素的ＲＰＭＩ１６４０中。
２．５ 细胞因子免疫测定
以植物血细胞凝集素（２００ｎｇｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ；Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）来激发培养的Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑中的淋巴细胞产生细胞因子。淋巴细胞（２×１０６ｍｌ ｉｎ ＲＰＭＩ１６４０）和促有丝分裂剂共同接种于３层９６孔板微量滴定盘中。对照孔加入等体积的培养液。在ＣＯ２培养箱中与植物血凝素在３７℃下孵育２４ｈ，将上清液离心后保存于－７０℃待测细胞因子。用酶联免疫吸附测定试剂盒（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）测定Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑中淋巴细胞上清液的ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１０及ＩＦＮγ的含量。
２．６ 淋巴细胞亚群分布
将１０５ｃｅｌｌｓ悬浮于含与荧光素结合的小鼠抗－大鼠ＣＤ３Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ和与藻红蛋白结合的小鼠抗大鼠ＣＤ４５ＲａＳｅｒｏｔｅｃ的１００μｌ Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐溶液中，分别鉴定分离于Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑的Ｂ淋巴细胞和Ｔ淋巴细胞的表型。结合荧光素的小鼠抗－大鼠ＣＤ８和结合藻红蛋白的小鼠抗大鼠ＣＤ４分别用来鉴定Ｔｈ细胞和细胞毒性Ｔ细胞。染色１５ｍｉｎ后，加入１ｍｌ红细胞溶解缓冲液（Ｓｅｒｏｔｅｃ）以溶解红细胞和固定染色的淋巴细胞。收集５×１０４个存活细胞的荧光数据，并用流式细胞仪分析（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）。
２．７ 抗体定量分析
测定血浆及小肠冲洗液的ＩｇＡ水平。小肠冲洗液的收集步骤参考文献所述并加以修改〔２〕。分离去除Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑后，截取靠近盲肠１２ｃｍ长的一段小肠，用５ｍｌ含１％蛋白酶抑制剂（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）的磷酸缓冲液冲洗肠腔。３０００ｒｐｍ离心小肠冲洗液１０ｍｉｎ以去除碎片，收集上清液、适度稀释后检测ＩｇＡ水平。血浆和小肠ＩｇＡ水平采用夹心型酶联免疫吸附法测定，此方法中，与抗大鼠ＩｇＡ结合的抗体（ｃｏｌｏｎ Ａ９３３；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）固定于盘上，用过氧化物酶标记的抗人ＩｇＡ检测抗体（ｃｏｌｏｎ Ａ９３２；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）检测抗体。小肠冲洗液中的ＩｇＡ水平以ｍｇｍｌ表示。
２．８ 统计分析
所得实验数据以均数±标准差表示。组间差异分析采用两因素方差分析及Ｆｉｓｈｅｒ检验。Ｐ＜０．０５为检验水准。
３． 结果
① 体重和血浆Ｇｌｎ水平
５组动物的初始体重、饲喂实验性饮食１０ｄ后及进行ＴＰＮ ３ｄ后的体重（数据未列出）不存在组间差异。Ｇｌｎ补充组（实验组２、３和４）的血浆Ｇｌｎ水平明显高于组１，但与对照组比较无显著性差异。
② 总Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑淋巴细胞产量
实验４组大鼠（＋＋）小肠上总Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑数目显著高于对照组和实验１组（－－），实验２组（－＋）和实验３组（＋－）则差异不显著。Ｇｌｎ补充组大鼠的总Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑淋巴细胞数量明显高于对照组，而实验１组和对照组间却未观察到明显差异（见图２Ｂ）。
③ 淋巴细胞亚群
５组动物Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑中的ＣＤ４５Ｒａ＋和ＣＤ８＋淋巴细胞数量无明显差别。实验１组（－－）动物的ＣＤ３＋和ＣＤ４＋细胞数量明显低于对照组，而Ｇｌｎ补充组与对照组间未观察到差异。
④ 血浆和小肠ＩｇＡ水平
Ｇｌｎ补充组的血浆ＩｇＡ水平明显高于对照组和实验１组（－－）。实验２组（－＋）和实验４组（＋＋）动物小肠冲洗液中的ＩｇＡ水平明显高于对照组和实验１组（－－）。
⑤ 体内细胞因子分泌量
实验组动物的激发Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑淋巴细胞分泌ＩＬ１０量显著低于对照组。ＩＦＮγ水平未见组间差别，而ＩＬ２和ＩＬ４则未能测出。
４ 讨论
体内和体外研究均表明补充Ｇｌｎ能够改善免疫应答。这些效果的临床意义已为一些动物和人体实验资料证实。由于Ｇｌｎ提供２５％的氨基总氮有助于促进鼠科动物的免疫应答，故在本研究中我们采用了这个用量。我们在ＣＬＰ后对大鼠进行３ｄ天的ＴＰＮ，是由于预实验发现在ＣＬＰ的第３天小肠浆膜部Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑的总数目比其它时候都要多。本研究未发现ＣＬＰ后补充Ｇｌｎ有利于提高动物的存活率。我们仅记录３ｄ的存活动物数，因此长期补充是否有助于提高动物的存活率有待深入研究。
Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑是胃肠道中被特化的淋巴滤泡集结。原初淋巴细胞在Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑中被激活，在肠系膜淋巴结中增生后经由胸腺导管迁移到不同粘膜部位的固有层中，并产生分泌型ＩｇＡ。 本研究中我们发现Ｇｌｎ补充组的总Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑淋巴细胞产量明显高于对照组，而在对照组和实验１组之间则未观察到有差异。结果表明ＣＬＰ后补充Ｇｌｎ能够促进ＧＡＬＴ中淋巴细胞增生，ＧＡＬＴ中总淋巴细胞数量增多。为了解Ｇｌｎ对Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑内总Ｂ淋巴细胞（ＣＤ４５Ｒａ＋）、总Ｔ细胞（ＣＤ３＋）、Ｔｈ细胞（ＣＤ４＋）和细胞毒性Ｔ细胞（ＣＤ８＋）分布的影响，我们分别对各类淋巴细胞计数。结果显示位于Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑的Ｂ细胞和细胞毒性Ｔ细胞组间无显著性差异。而实验１组的ＣＤ３＋和ＣＤ４＋则显著低于对照组，而在Ｇｌｎ补充组和对照组之间则未观察到明显差异。结果说明ＣＬＰ前和或ＣＬＰ后给以Ｇｌｎ有助于维持败血症状态下Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑内的总Ｔｌ和Ｔｈ淋巴细胞群。这个结果类似于Ａｌｖｅｒｄｙ等的报道，即向标准ＴＰＮ液加入Ｇｌｎ有助于维持肠粘膜固有层中的ＣＤ４＋细胞水平类似于经口喂养饲料的动物。 分泌型ＩｇＡ是机体对抗侵袭性病原体的特异性免疫的主要效应因子。本实验中，我们发现实验２组（－＋）和４组（＋＋）的血浆及小肠ＩｇＡ水平明显高于未补充Ｇｌｎ组。还发现实验３组（＋－）的血浆ＩｇＡ浓度高于实验１组和对照组。这些结果说明在ＣＬＰ前和／或ＣＬＰ后给以Ｇｌｎ能促进ＩｇＡ的分泌。各Ｇｌｎ补充组动物的Ｐｅｙｅｒ＇ｓ斑内的淋巴细胞产量、淋巴细胞亚群分布以及ＩｇＡ分泌量组间未见有显著性差异，因此ＣＬＰ前和ＣＬＰ后给予Ｇｌｎ似乎对提高肠粘膜免疫功能无协同作用。
细胞因子是免疫系统细胞产生的多肽类物质，是作为免疫应答和组织受损反应的调节因子。为了解细胞因子的分泌对小肠免疫机能的可能作用，我们测定了有丝分裂原刺激的Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑淋巴细胞培养组织中ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１０和ＩＦＮγ的产生水平。ＩＬ２和ＩＦＮγ由Ｔｈｃｅｌｌ产生。Ｔｈ１细胞因子增强细胞免疫。Ｔｈ１细胞的主要效应是活化Ｔｃｅｌｌ。Ｔｈ２细胞因子包括ＩＬ４和ＩＬ１０增强体液免疫。Ｔｈ２细胞的主要效应是活化Ｂｃｅｌｌ和上调抗体的产生。Ｔｈ１和Ｔｈ２淋巴细胞的效应呈反向调节。Ｋｕｄｓｋ等报道富含Ｇｌｎ的ＴＰＮ能校正小肠ＩＬ４和ＩＬ１０的产生，因而能够维持小肠的ＩｇＡ水平。我们对体外Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑产生的细胞因子作分析后发现，ＩＬ２、ＩＬ４和ＩＦＮγ无法检测或经有丝分裂原刺激后５组间不存在组间差异。４个实验组动物ＩＬ１０的产量无组间差异，但均低于对照组。本实验中未观察到小肠ＩｇＡ和体外Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑ＩＬ４和ＩＬ１０产量之间具可比性改变的数据。可能的原因是ＩＬ４或ＩＬ１０活性的峰值时间出现在我们测定之前，或者是这些细胞因子的生物活性水平正好低于现有免疫测定方法的检测范围。目前我们实验室正在对脾脏和Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑细胞因子的ｍＲＮＡ表达进行定量分析研究。
总之，本研究的结果表明从预防性使用补充Ｇｌｎ的肠内膳食和ＣＬＰ后静脉输注Ｇｌｎ均可促进败血症大鼠ＧＡＬＴ的总淋巴细胞的增生、增强ＩｇＡ的分泌及维持Ｐｅｙｅｒ’ｓ斑Ｔ淋巴细胞群和血浆Ｇｌｎ水平。ＣＬＰ前和ＣＬＰ后使用Ｇｌｎ似乎对增强肠源性败血症大鼠肠粘膜免疫功能无协同作用。
部分参考文献：
１． Ｊａｎｕ Ｐ Ｌｉ Ｊ Ｒｅｎｅｇａｒ ＫＢ Ｋｕｄｓｋ ＫＡ． Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｇｕｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ． Ａｎｎ Ｓｕｒｇ，１９９２，２２５ ７０７－７１５．
２． Ｐｅｒｄｉｇｏｎ Ｇ Ａｌｖａｒｅｚ Ｓ Ｐｅｓｃｅ ｄｅ Ｒｕｉｚ Ｈｏｌｇａｄｏ Ａ． Ｉｍｍｕｎｏａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｒａｌ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｏｓｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ １９９１ ５８ ４８５－４９６．
译自：Ｎｕｔｒｔｉｏｎ ２００４ ２０３２８６－２９１ | 