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黄 玥 王 劲(Ｈ．Ｍ． Ｐａｔｅｌ Ｓ．Ｓ． Ｐａｎｄｉｅｌｌａ Ｒ．Ｈ． Ｗａｎｇ Ｃ． Ｗｅｂｂ)
摘要：根据乳酸杆菌发酵谷类底物的能力和耐受模拟胃转运的能力，选出３种乳酸杆菌株，测定它们的胆汁耐量。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＮＣＩＭＢ １１９５ Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＩＭＢ ８８２１ 和 Ｌ． ＰｌａｎｔａｒｕｍＮＣＩＭＢ ８８２６ 在ｐＨ ７的磷酸盐缓冲液中暴露于２％ 的胆汁４ ｈ。同时还测定了添加谷类提取物、升高的糖浓度及游离氨基氮（ＦＡＮ）浓度等的效应。在无任何添加物的环境中，Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ表现出对胆汁最大的抵抗性，而Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ显示最大的敏感性。 添加谷类提取物会提高所有３种乳酸杆菌株的胆汁耐受力，大麦小麦提取物提高乳酸杆菌活力相当，而麦芽提取物表现出更大的增强效应。提高的程度和谷类中的可溶性糖和ＦＡＮ浓度有关。这一点通过在培养基中添加糖，随着糖浓度的升高菌体的活力也逐步提高而得到进一步证实。游离氨基氮也能提高细菌对胆汁的抵抗，但影响程度弱于糖及谷类提取物。
关键词：麦芽；小麦；大麦；乳酸菌；提取物
１ 简介
益生菌食物（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｆｏｏｄｓ）是膳食补充剂，包含一种或多种微生物，这些微生物有益于改善食用者的肠道微生物的平衡。许多营养与治疗效应得益于益生菌，包括乳糖代谢、控制胃肠道感染、抑制癌症、降低血清胆固醇、免疫刺激和提高食物消化率等。益生菌的治疗功能由许多因素决定，但最重要的是食品生产、储存、通过胃肠道转运时细菌的存活力和细菌在大肠中的繁殖能力。选择合适的菌株必须考虑这些因素。
益生菌通过食道面临的主要的挑战是胃分泌的胃酸及释放到十二指肠的胆盐。许多研究者研究了在胆盐和低ｐＨ环境中微生物的存活力，并明确了益生菌在体内和体外的存活力与其借以运输的食物载体的种类有很大影响。缓冲能力、ｐＨ及食物载体的物理化学特性都是重要因素。
益生菌的载体食物通常是发酵食物，当然，也可以是果汁饮料、甜牛奶、婴儿食品及糖果等。在发酵的益生菌产品中，益生微生物必须能使产品具有良好的感官特性，因为这个原因，使用益生菌作为基底培养菌时通常结合使用其他适合产品特性的微生物。例如，益生菌酸乳酪常在生产时添加嗜热链球菌和德氏乳杆菌以达到理想的感官特性。
本研究是评估谷类作为开发益生菌产品底物可能性的项目里的分课题。谷类对于益生菌株的生长来说是很好的基底物，这是由于谷类基质中含有不能被消化的益生元成分。然而，由于谷物的多样性，因而需要一种系统的方法来确定哪些因素可能提高益生菌株在体内和体外的生长和存活。
以前本实验室的实验研究集中于研究人源性的乳酸杆菌株对模拟胃酸的抵抗能力，和谷类提取物（麦芽，小麦，大麦）及它们的成分（葡萄糖，麦芽糖和游离氨基氮）提高酸耐受的能力等。结果显示，麦芽、小麦、大麦提取物在酸性条件下对乳酸杆菌生物活性有很明显的保护效应，进一步研究揭示，这种效应主要归功于谷类的糖含量多少。本研究旨在评价３种菌株对已知人体小肠中最高胆汁酸盐浓度的胆汁耐受力，同时研究了谷类基底物及其成分对这些菌株的胆汁耐受的影响。
２ 材料和方法
２．１ 原料和培养物的保存
根据发酵谷物基底物的能力和在低ｐＨ环境下的存活力，选择本次研究所用的３种菌株，菌株来源于“国家工业与海洋细菌收藏中心”（ＮＣＩＭＢＡｂｅｒｄｅｅｎＳｃｏｔｌａｎｄ。它们是：Ｌ． ＲｅｕｔｅｒｉＮＣＩＭＢ １１９５，分离自人体肠道，Ｌ． ＰｌａｎｔａｒｕｍＮＣＩＭＢ ８８２６ 分离自人体唾液和Ｌ． ＡｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＮＣＩＭＢ ８８２１，同样分离自人体唾液。储备培养物维持在４℃的ＭＲＳ琼脂培养基ＯｘｏｉｄＢａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ ＵＫ中，并每月传代培养。操作培养物保存在ＭＲＳ肉汤Ｏｘｏｉｄ中。
２．２ 制备清洗的细胞悬浮液
乳酸杆菌培养物在３７℃的ＭＲＳ肉汤中过夜生长后进一步转移至新鲜ＭＲＳ中１６ｈ，然后离心４５００ｇ１０ｍｉｎ，接着以１４浓度的Ｒｉｎｇｅｒｓ液Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ清洗一次，然后重悬至 Ｒｉｎｇｅｒｓ液中，并配至与原始培养物体积相同。
２．３ 谷物提取物的制备
使用一个带有０．５ｍｍ滤网的磨粉机Ｐｅｒｔｅｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＳｗｅｄｅｎ将麦芽、小麦、大麦磨成粉。然后混悬于自来水中２０％，ｗｗ，室温下轻柔混匀１５ｍｉｎ。再将此糊浆离心（６０００ｇ，３０ｍｉｎ）后，倒出上清液，调ｐＨ至７．２０５ｍｏｌ ＨＣｌ，然后高压灭菌１２１℃，１５ｍｉｎ。
２．４ 胆汁，葡萄糖和酵母提取物溶液的制备
３％和６％的牛胆汁溶液Ｏｘｏｉｄ在磷酸盐缓冲液Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ ９ｇＬ ＮａＣｌ ９ｇＬ ＫＨ２ＰＯ４ １．５ｇＬ 中制备，酵母提取物储备液Ｏｘｏｉｄ配制成２、４．５、６和９ｇＬ的浓度备用，葡萄糖Ｏｘｏｉｄ溶液配制成２、５、１０、１５、２０和２５ｇＬ浓度备用。所有３种溶液调节到ｐＨ ７．００后，用上述方法高压灭菌。
２．５ 乳酸杆菌胆汁盐抵抗力的测定
将６％牛胆汁溶液５ｍｌ分别移至一系列１５ｍｌ的离心管中，再往离心管内分别加入５ｍｌ麦芽、大麦及小麦的提取物，然后加入５ｍｌ细胞悬浮液，在３７℃下孵育。反应体系最后的胆汁浓度是２％、ｐＨ为７．００±０．１０。在暴露０、１、２、３和４ｈ后，用Ｒｉｎｇｅｒｓ溶液分别稀释１０倍后，平铺于ＭＲＳ琼脂上，用ＭｉｌｅｓＭｉｓｒａ方法对活力菌计数。平板在３７℃下孵育４８ｈ，生物活力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）以ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ计算。
葡萄糖和酵母提取物的效应也使用上面的方法，只是以５ｍｌ的葡萄糖溶液２．００～２５．００ｇＬ或酵母提取物０．６０～３．００ｇＬ，相当于ＦＡＮ浓度１３～４８ｍｇＬ代替谷类提取物。对照组实验使用３％的胆汁溶液（也就是反应体系中最后的浓度为１％）来重复进行。
本实验添加了谷类提取物、葡萄糖和酵母提取物，使用２％的胆汁浓度是因为考虑到Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ和Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍｗａｓ这两种菌株在１％浓度时已有很明显的抵抗，那么在更高浓度的胆汁中添加物的效应会因为有更多细胞数量的减少而更易于测定。
２．６ 化学分析
可溶性糖总量使用硫酚法１，ＦＡＮ含量使用 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ’ｓ 法２，二者均通过比色法测量。
３ 结果和讨论
胆盐由初级胆汁酸在肝脏中由胆固醇合成。在分泌到小肠腔内之前，它们和甘氨酸，牛磺酸，硫酸盐，葡萄糖醛酸或葡萄糖结合。虽然牛磺酸／甘氨酸的比例在不同个体及不同膳食人群中变化很大，但与乙二醇和牛磺酸结合的胆汁酸是人体主要的胆汁酸。进入小肠上部，它们脂肪的消化和吸收。 这对于微生物体来说是关键的，因为它们的细胞膜是由脂质和脂肪酸构成的，并且一般认为细胞的死亡是由分解所致。 还有一种观点认为胆汁酸盐象有机酸一样，通过酸化细胞质而影响它的毒性，即弱酸能以其分子形式通过被动扩散进入细胞，然后在细胞质中释放出氢离子。乳酸杆菌和其他许多生物体一样，Ｈ＋ＡＴＰ酶消耗ＡＴＰ的能量，排出的质子来调节其胞质中的ｐＨ值。通过比较乙酰脱氧胆酸ＧＤＣＡ、乙酰胆酸ＧＣＡ、牛磺鹅脱氧胆酸ＴＤＣＡ、牛磺鹅胆酸ＴＣＡ、胆汁酸ＣＡ和脱氧胆酸ＤＣＡ等对细胞的影响以及监测胆盐水解酶ＢＳＨ活力的影响后，许多研究者指出细胞内的酸化可能是细胞在富胆汁溶液中死亡的主要原因。ＢＳＨ能水解连接胆汁酸的肽链，这种酶在许多肠道细菌中能发现，它们分属于广泛的细菌种属，例如乳酸杆菌、链球菌属、双歧杆菌、肠球菌、拟杆菌属和梭菌属等。Ｄｅ Ｓｍｅｔ等揭示ＧＣＤＡ比ＴＤＣＡ对乳酸杆菌的毒性更大而且在低ｐＨ值环境中胆盐的毒性更大。ＢＳＨ活力和耐受力之间的关系揭示出这种酶可能是提高对胆盐抵抗力的原因。ＧＤＣＡ比ＴＤＣＡ具有更高毒性被认为是和它们不同的分解产物有关，ＧＤＣＡ和ＴＤＣＡ的ｐＫａ值分别是３．９和１。由于ＴＤＣＡ是种强酸，这种化合物几乎全部以其解离形式存在接近中性ｐＨ环境中，因此其以非解离形式进入并酸化细胞的数量可以忽略不计。而由于ＧＤＣＡ是种很弱的酸，相对而言其质子化存在形式的数量较大，它能够进入细胞并降低细胞内的ｐＨ。能表达ＢＳＨ酶的菌株，表现出能将质子化的ＧＤＣＡ转换为游离的ＤＣＡ的能力这是一种更弱的酸ｐＫａ ５。理论上，弱酸然后能重新捕获结合传输的质子并且通过被动扩散将其传递出细胞，因此能避免酸化。因此，不具有ＢＳＨ活性的菌株必须额外消耗 ＡＴＰ通过Ｈ＋ＡＴＰ酶来维持其内部的ｐＨ。
其他研究者观察到在没有其他营养素的情况下，胆汁的毒性是直接和ＢＳＨ活力成比例的。这可能是由于相对于结合胆盐，ＢＳＨ形成的游离胆盐具有更大的毒性。虽然次级胆盐是非常弱的酸，不能降低细胞质的ｐＨ，但它们能通过其更高的疏水性来裂解细胞膜，从而破坏细菌的细胞。虽然ＢＳＨ活力是用来降低胆汁的毒性效应的，但是有一个问题出现了，即为什么在细菌受到更大的抑制时会产生活性。答案可能就是在适度的酸性环境里（比如小肠），ＢＳＨ阳性细胞可能得益于脱羟基胆汁的细菌。脱羟基胆酸在酸性溶液里溶解性降低并沉淀，因而其生物活性降低。由于营养素的利用率能降低游离胆盐的毒性，因此另一种可能是在某些肠道微生物体内存在第二种尚未被发现的依赖ＡＴＰ的非结合胆汁解毒步骤。
本次研究在２％的牛胆汁中，Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ是最敏感的菌株，其活菌菌落减少了２．８５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ其次，活性减少了１．９４ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ， 而最耐受菌株是Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ，仅降低了１．１３ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ表１。
在添加了谷类后，Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ的耐量显著提高，提高量分别是：添加麦芽为２．４６ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，添加小麦和大麦为２．４５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和２．４０ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。在Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ和Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ中添加谷类也能提高其耐量，只是提高的程度很微弱。麦芽提取物再次显示出最大的效应，能提高活性分别至１．６５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和１．００ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。然而小麦和大麦降低Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ细胞死亡至１．３４ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和１．２６ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ至０．７５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和０．８１ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。很明显对于每一种菌株，对胆盐抵抗力的提高取决于所使用的谷类提取物。
通过表２，我们看到麦芽、小麦和大麦增强抵抗胆盐的保护效应都和化学成分是直接相关的。小麦和大麦的提取物包含相当于麦芽１３的总糖含量（分别为４．７６和４．５４ｇＬ，麦芽为１１．２１ｇＬ）和大约１３的ＦＡＮ含量１９．４５、１７．１１以及５７．１２ｍｇＬ。这是由于淀粉分解酶和蛋白水解酶的活性，它们能对麦芽制作过程中谷物中的淀粉和蛋白质起水解作用。相对小麦和大麦，升高的游离氨基氮含量能提高麦芽提取物的缓冲力。
为了研究添加谷物后胆汁耐量的提高是由于哪种成分，分别使用葡萄糖和酵母提取物研究各自的作用。图１中显示了随着葡萄糖浓度的升高，暴露２％的胆汁４ｈ后，葡萄糖对于菌株生物活性的影响。对于全部的菌株都观察到，随着葡萄糖浓度的升高对胆汁酸的抵抗也逐步加强，支持了Ｄｅ Ｓｍｅｔ等的假设。
正如我们初期的实验一样，Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ再次表现为最具抵抗力的菌株。往反应体系中加入８．３３ｇＬ的葡萄糖造成大约０．３５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ细胞减少，这和加入小麦和大麦提取物后所观察到的水平差不多，但比麦芽高一些。在仅有胆盐存在时，Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ比Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ耐受量大得多，然而当仅加入０．６７ｇＬ葡萄糖时，胆汁的杀菌作用对Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ的活性有较大下降，由２．８５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ降至１．７５ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，然而Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ的活性则没影响。 虽然在仅有胆汁存在时Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ表现出最大的敏感性，但在各浓度中，当反应体系中有葡萄糖时，Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ比Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ更具抵抗性。在最高葡萄糖浓度时，Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ的细胞计数降到０．８８ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，说明改善了１．０６ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ的细胞数减为０．６１ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ，即改善了１．２ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。和对照组相比，每种菌株具有统计学意义上生物活性提高的阈值在不同葡萄糖浓度下是不同的。Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ直到５ｇＬ葡萄糖浓度时才观察到生物活性的改善，而Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ和Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ分别为０．６７ｇＬ和１．６７ｇＬ。
由于Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ和Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ对胆汁的敏感性最大，所以使用这两种菌株来研究ＦＡＮ对胆汁耐量的影响。在有葡萄糖存在时，细胞的生物活性随着ＦＡＮ含量的提高而逐步提高。这可再次由Ｄｅ Ｓｍｅｔ等提出的理论来解释，因为乳酸杆菌能利用氨基酸作为可发酵的碳源产生ＡＴＰ。在４８ｍｇＬ的ＦＡＮ浓度下，Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ和Ｌ．Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ细胞死亡分别降至０．５６ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ和１．２７ ｌｏｇ１０ｃｆｕｍｌ。因为葡萄糖存在时，Ｌ．Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ的胆汁耐量改善最多。酵母提取物的保护效应比相同浓度的葡萄糖要低，这提示着提高体内胆汁耐量，碳水化合物比ＦＡＮ可能更重要。以前的研究者发现食物成分在胃肠道转运时，由于具有食物成分的缓冲能力也能提高菌株的存活力 由于ＦＡＮ能提供一定的缓冲能力因而谷物必定也是如此，然而，在我们的研究中，由于将所有反应体系的都调整到ｐＨ７的环境中因而没有对缓冲能力的效应的进行观察。
已有许多实验研究了胆汁对不同种类细菌的影响；然而，对于食品或食物成分这类可能具有保护效应的因素的研究却很少。我们的研究结果提示，可发酵的碳源是减轻胆汁有害效应的关键所在，这和其他研究者的结果一致。对ＢＳＨ活性的双歧杆菌属的实验研究发现，相对单糖组分而言，低聚糖能提高抵抗胆汁的杀菌作用。这也支持了我们的实验结果，说明谷类提取物，尤其是麦芽提取物比仅存在葡萄糖时发挥更强的保护效应。这可能是由于非还原的蔗糖和可溶性的低聚糖存在的结果，它们能通过和葡萄糖相似的途径来提高对胆汁耐量。当然ＦＡＮ和还原糖联合存在时也能提高乳杆菌属的胆汁耐量。尽管明确了可溶性糖对于乳酸杆菌在体外的胆汁耐受很重要，但是这些成分在体内却不能发挥保护效应，因为它们在小肠中很快就被吸收了。而谷类含有大量的不能被消化的碳水化合物，比如抗性淀粉、β葡聚糖、水苏糖、棉子糖、果糖低聚糖等，都表现出了胆汁的保护效应。
虽然对于所有菌株而言，加入葡萄糖和谷类都能提高它们的胆汁耐量，但是各菌株之间观察到若干差异。２％胆汁中，加入麦芽提取物，Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ比Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ具有更大胆汁耐量，但若加入小麦、大麦或者葡萄糖等，则具有相反结果。这提示着在选择益生菌株时，营养素的选择和菌株的选择一样关键。
对于ＢＳＨ活力特定部位和胆汁耐量的研究发现，从几乎肠道分离的细菌都具有ＢＳＨ活力。同时也进一步证实了肠道分离的细菌比从体内其他部位或食物中分离的细菌对胆盐更具耐受性。我们的研究也证实了这点，在任何测试环境下，由肠道分离的Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ比从唾液分离的Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ和Ｌ．Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ对胆汁更为耐受。
本研究结果的结论是，麦芽、小麦、大麦提取物通过减少胆盐的毒性，而对Ｌ． Ｒｅｕｔｅｒｉ，Ｌ． Ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ和Ｌ． Ｐｌａｎｔａｒｕｍ等起保护作用。由于谷类中的个别组分具有这些有益效应，所以谷类的成分与这种保护效应有关。
部分参考文献：
１． Ｄｕｂｏｉｓ Ｍ． Ｇｉｌｌｅｓ Ｋ．Ａ． Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｊ．Ｋ． Ｒｅｂｅｒｓ Ｐ．Ａ． Ｓｍｉｔｈ Ｆ． Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ １９５６ ２８３５０－３５６．
２． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ １９８７． Ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ． Ａｎａｌｙｔｉｃａ． ＥＢＣ Ｚüｒｉｃｈ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ ｐｐ． Ｅ１４１．
译自：Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００４ ２１ ８３－８９ | 