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杨 红 杨 毅 王卫平(上海医科大学儿科医院儿保科及儿研所，上海 ２０００３２)
摘要：目的 研究视黄酸（ＲＡ）促进脐血淋巴细胞（ＣＢＬ）细胞因子表达的作用途径，探讨视黄酸受体α在该过程中的可能作用。方法 收集１９例健康新生儿的脐血标本进行体外培养，采用ＲＴＰＣＲ法检测ＣＢＬ中视黄酸受体α（ＲＡＲα）、ＩＬ２、ＩＦＮγ和ＩＬ４的ｍＲＮＡ水平。结果 ＲＡ上调ＣＢＬ中ＲＡＲα的基因表达水平，培养２４ｈ时的上调幅度为（１．１７±０．０７）倍（Ｐ＜０．００１）。ＲＡ上调ＩＬ２的基因表达水平，培养２４ｈ时的上调幅度为（１．２９±０．２０）倍Ｐ＜０．００１）。ＲＡ也上调ＩＦＮγ的基因表达水平，培养４８ｈ时的上调幅度为（１．３９±０．２６）倍Ｐ＜０．００１）。ＲＡ还上调ＩＬ４的基因表达水平，培养２４ｈ时的上调幅度为（１．５２±０．４４）倍Ｐ＜０．００２）。ＲＡ使ＲＡＲα基因表达的上调幅度与ＲＡ使ＩＬ２、ＩＦＮγ和ＩＬ４基因表达的上调幅度皆存在正相关，ｒ 值分别为０．４０、０．３９和０．４６Ｐ＜０．０５。结论 ＲＡＲα可能参与ＲＡ对ＣＢＬ细胞因子（ＩＬ２、ＩＦＮγ和ＩＬ４）表达的促进作用。ＲＡ可能通过增加ＲＡＲα的表达而上调ＩＬ２、ＩＦＮγ及ＩＬ４等细胞因子的表达，从而促进ＣＢＬ的功能。
关键词：视黄酸受体；基因表达；胎血；淋巴细胞；细胞活素类
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｐａｔｈ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＲＡｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓＣＢＬ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｉｎｅｔｅｅｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓａｎｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｎｅｗｂｏｒｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ＣＢＬ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｒｅｔｏｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒαＲＡＲα，ＩＬ２，ＩＦＮγ ａｎｄ ＩＬ４ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎＲＴＰＣＲ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＲＡＲα ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｗａｓ１．１７±０．０７ｔｉｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓ（Ｐ＜０．００１）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ２ ｗａｓ ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ＲＡ，ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｗａｓ（１．２９±０．２０）ｔｉｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓＰ＜０．００１）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮγ ｗａｓ ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ＲＡ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｗａｓ（１．３９±０．２６）ｔｉｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ４８ ｈｏｕｒｓＰ＜０．００１）． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ４ ｗａｓ ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ＲＡ，ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｗａｓ（１．５２±０．４４）ｔｉｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓＰ＜０．００２）． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ＲＡＲα ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅｓ ｏｆ ＩＬ２、ＩＦＮγ ａｎｄ ＩＬ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ，ｒ＝０．４０ ０．３９ ０．４６ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＰ＜０．０５． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＲＡＲα ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｉｖｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ＣＢＬ ｂｙ ＲＡ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｆｅｔａｌ ｂｌｏｏｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ
许多研究表明类维生素Ａ能够促进免疫细胞的功能１， 但其作用途径和机制有待进一步阐明。这些年细胞因子的作用日益受到重视，本研究采用逆转录聚合酶链反应（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＲＴＰＣＲ）技术，检测类维生素Ａ代表分子——视黄酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ＲＡ）对脐血淋巴细胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＣＢＬ）中视黄酸受体α（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒα， ＲＡＲα）和一些细胞因子基因表达水平的调节，以探讨ＲＡ对脐血淋巴细胞细胞因子表达的促进作用是否通过ＲＡＲα调节的途径。
１ 材料与方法
１．１ 淋巴细胞体外培养
脐血获自上海市金山区金卫乡卫生院母婴健康的顺产新生儿，分离单核细胞后，用ＲＰＭＩ１６４０培养液（ＧＩＢＣＯ产品）悬浮细胞为１０６ｍｌ，培养在９６孔Ｕ型板中，加入ＰＨＡ（上海市医学化验研究所产品），深度为５０ｍｇＬ；视黄酸（ＲＡ，Ｓｉｇｍａ公司产品），浓度为１×１０－６ｍｏｌＬ 在培养６、２４、４８和７２ｈ后分别收获细胞，留置未培养的单核细胞作为对照。
１．２ ＲＴＰＣＲ检测ＲＡＲα、ＩＬ２、ＩＦＮγ和ＩＬ４ｍＲＮＡ
１） 总ＲＮＡ抽提 培养前后的脐血淋巴细胞采用ＴＲＩｚｏ１试剂（ＧＩＢＣＯ产品）提取制备总ＲＮＡ，用紫外分光光度计（日本岛津ＵＶ１６０１）测定Ａ ２６０进行准确定量。
２） 引物设计 参考国外文献并采用计算机辅助设计，引物由中国科学院上海生物化学研究所合成。
３）ＲＴＰＣＲ 取１μｇ总ＲＮＡ经逆转录酶（ＧＩＢＣＯ产品）催化合成ｃＤＮＡ第１链，并以此为模板进行ＰＣＲ扩增，取扩增产物１０μｌ琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察结果并照相（英国ＵＶＰ公司紫外凝胶成像及分析仪）。
１．３ 结果分析与显著性检验
采用紫外凝胶成像及分析系统（英国ＵＶＰ公司）对电泳凝胶中的ＰＣＲ产物条带进行定量分析。配对资料比较的显著性检验采用配对 ｔ 检验，直线相关系统的显著性检验根据 ｒ 值直接查 ｒ 界值表。
２ 结果
２．１ ＲＡ对体外培养的ＣＢＬ中ＲＡＲα基因表达的调节
ＣＢＬ在ＰＨＡ刺激下，ＲＡＲ基因表达水平很快升高，２４ｈ达高峰。加入ＲＡ共同培养后即观察到ＲＡ对ＲＡＲα表达的显著上调。培养２４ｈ时上调幅度为（１．１７±０．０７）倍ｔ＝４．８４８ Ｐ＜０．００１。
２．２ ＣＢＬ中细胞因子基因表达的调节及其与ＲＡＲα
ｍＲＮＡ水平变化的相关性
ＣＢＬ在ＰＨＡ刺激下，ＩＬ２基因表达水平很快升高，２４ｈ达到高峰。加入ＲＡ共同培养后即出现ＲＡ对ＩＬ２表达的显著上调，培养２４ｈ时的上调幅度为（１．２９±０．２０）倍ｔ＝５．４８３ Ｐ＜０．００１。分析ＲＡ使ＲＡＲα基因表达的上调幅度与ＲＡ使ＩＬ２基因表达的上调幅度发现存在正相关关系ｒ＝０．４０ Ｐ＜０．０５图１。
ＣＢＬ在ＰＨＡ刺激下，ＩＦＮγ基因表达水平逐步升高，４８ｈ达到高峰。加入ＲＡ共同培养后即出现ＲＡ对ＩＦＮγ基因表达的显著上调，培养４８ｈ时的上调幅度为（１．３９±０．２６）倍ｔ＝４．６８８ Ｐ＜０．００１。分析ＲＡ使ＲＡＲα基因表达的上调幅度与ＲＡ使ＩＦＮγ基因表达的上调幅度发现存在正相关关系ｒ＝０．３９ Ｐ＜０．０５图２。
ＣＢＬ在ＰＨＡ刺激后，ＩＬ４基因表达水平很快升高，２４ｈ达到高峰。加入ＲＡ共同培养后即出现ＲＡ对ＩＬ４表达的显著上调，培养２４ｈ时的上调幅度为（１．５２±０．４４）倍ｔ＝３．７７０ Ｐ＜０．００２。分析ＲＡ使ＲＡＲα基因表达的上调幅度与ＲＡ使ＩＬ４基因表达的上调幅度发现存在正相关关系ｒ＝０．４６ Ｐ＜０．０５图３。
３ 讨论
许多研究表明类维生素Ａ是一类重要的免疫功能调节剂，对Ｔ、Ｂ淋巴细胞的活化、增殖和分化具有重要的调节作用１。在类维生素Ａ促进Ｔ、Ｂ淋巴细胞功能的机制研究中，细胞因子的作用日益受到重要。已发现受类维生素Ａ调节表达的细胞因子包括ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ１、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＧＦβ及ＴＮＦα等２５。
细胞因子参与免疫应答的全过程，在参与免疫应答的Ｔ、Ｂ等淋巴细胞间进行信息传递。ＴＨ１类细胞因子（ＩＬ２、ＩＦＮγ等）和ＴＨ２类细胞因子（ＩＬ４）等对Ｔ、Ｂ细胞功能具有重要的调节作用。本研究表明ＲＡ使体外活化ＣＢＬ中ＩＬ２、ＩＦＮγ及ＩＬ４的ｍＲＮＡ表达水平明显升高，揭示ＲＡ能够通过上调ＴＨ１、ＴＨ２类细胞因子的表达，从而促进ＣＢＬ的功能。但是ＲＡ通过何种途径调节细胞因子的表达，尚有待阐明。１９８７年视黄酸受体（ＲＡＲｓ）的发现６，大大促进并深化了对维生素Ａ增强免疫功能的机制研究。视黄酸受体属于类固醇甲状腺激素核内受体超家族成员，包括３种亚型：ＲＡＲα、ＲＡＲβ和ＲＡＲγ。其中ＲＡＲα在细胞中的表达最为广泛。近几年来，我们既往的研究发现７人外周血淋巴细胞中主要表达ＲＡＲα，且ＲＡＲα基因的转录表达受线裂原和ＲＡ的调节。本研究再次表明ＲＡ上调ＰＨＡ活化ＣＢＬ中ＲＡＲα基因表达水平，提示ＲＡＲα可能参与ＲＡ对淋巴细胞的调节功能。ＲＡＲα是类维生素Ａ依赖的转录因子，位于细胞核内基因转录的调控区，受其调节的基因有５０余种，包括ＲＡＲβ、层粘蛋白Ｂ１和垂体生长激素等基因８。本研究发现，ＲＡ上调ＲＡＲα基因表达幅度与ＲＡ上调ＩＬ２、ＩＦＮγ及ＩＬ４基因表达幅度间皆存在正的相关关系，提示ＲＡＲα可能参与ＲＡ对ＣＢＬ细胞因子表达的促进作用。ＲＡ可能通过增加ＲＡＲα的表达而上调ＩＬ２、ＩＦＮγ及ＩＬ４等细胞因子的表达，从而促进ＣＢＬ的功能。
儿童的维生素Ａ营养水平与其免疫功能的关系日益受到临床医生的重视，研究表明适量维生素Ａ营养能够促进儿童免疫系统的发育和功能。进一步阐明维生素Ａ促进Ｔ、Ｂ淋巴细胞功能的作用机制，将为在儿童中开展维生素Ａ补充干预试验提供理论和实验依据，也能为治疗其他免疫缺陷病提供新的途径。
参考文献：
１． Ｓｅｍｂａ ＲＤ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎｕｔｒ Ｒｅｖ． １９９８ ５６ Ｓ３８－４８．
２． Ｃａｎｔｏｒｎａ ＭＴ Ｎａｓｈｏｌｄ ＦＥ Ｈａｙｅｓ ＣＥ． Ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｅｘｃｅｓｓ Ｔｈ１ ａｎｄ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｈ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９４ １５２４１５１５－１５２２．
３． Ｂａｌｌｏｗ Ｍ Ｘｉａｎｇ Ｓ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＳＪ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ２ ｍＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＩＬ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ １１３１－３１６７－１６９．
４． Ｂａｌｌｏｗ Ｍ Ｘｉａｎｇ Ｓ Ｗａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６１６３１７１－１７９．
５． Ｃａｒｍａｎ ＪＡ Ｈａｙｅｓ ＣＥ． Ａｂｎｏｒｍａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮｇａｍｍａ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９１ １４７４１２４７－１２５２．
６． Ｐｅｔｋｏｖｉｃｈ Ｍ Ｂｒａｎｄ ＮＪ Ｋｒｕｓｔ Ａ Ｃｈａｍｂｏｎ Ｐ． Ａ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｈｉｃｈ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｎａｔｕｒｅ． １９８７ ３３０６１４７４４４－４５０．
７． 王卫平 杨毅 苏贻新． 人外周血淋巴细胞视黄酸受体基因的表达与调控． 营养学报 １９９８ ２０２７０－２８５．
８． Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｙ． Ｒｅｔｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ． １９９１ １６２１１３－１２３． | 