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Ｓｙｅｄａ Ｓｈｅｇｕｆｔａ Ａｍｅｅｒ，Ｊｏｂａｙｅｒ Ｃｈｉｓｔｉ，ａｎｄ Ｊａｎ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ 刘艳妮 王 劲译
志贺氏菌痢，一种杆菌痢疾，是发展中国家儿童发病和死亡的一个主要原因，尤其是５岁以下儿童。在发展中国家，因频繁感染志贺氏菌而造成儿童的营养不良、生长迟缓，甚至引发危及生命的并发症。严重营养不良儿童患志贺氏菌痢的死亡率极高。患志贺氏菌痢的营养不良儿童与非营养不良的同类患者比较，有丝分裂原刺激指数较低、ＣＤ４∶ＣＤ８比例较低和转铁蛋白浓度较低。
缺锌与腹泻和呼吸道疾病发病增高有关。一些双盲、安慰剂对照临床实验证明，长期补锌能够减少急性迁延性腹泻和痢疾的发病率、减轻疾病的严重程度及缩短患病时间，还能降低急性下呼吸道感染的发病率。尽管关于补锌对人体特异性免疫的影响的研究有限，但已经证实补锌能够改善儿童的细胞免疫功能。作为抗氧化剂锌能够保护细胞免受免疫激活时产生的氧自由基的损害。事实也证明，对患急性或迁延性腹泻的营养不良儿童补锌可降低小肠的渗透性，这反映了小肠粘膜修复的增强。缺锌对免疫系统的不良影响很可能是增加儿童罹患腹泻的易感性，而慢性或迁延性腹泻又会进一步影响机体的营养状态从而引起锌的缺乏。故可以推断，给志贺氏菌痢患者补锌有益于调节机体的免疫和炎性应答。因此本文旨在于研究给患志贺氏菌痢的中度营养不良儿童补锌后，观察锌对于机体先天性和特异性免疫应答以及炎性应答的影响。
１ 对象和方法
１．１ 研究对象
有剧烈腹绞痛、粘液样血便、并就诊“腹泻病国际研究中心临床研究服务中心，孟加拉国（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉａｒｒｈｏｅａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂａｎｇｌａｄｓｈ；ＩＣＤＤＲ，Ｂ）：达卡健康与人群研究中心，孟加拉国（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｄｈａｋａ，Ｂａｎｇｌａｄｓｈ）”的小儿患者被初筛选为研究对象。粪便标本经镜检并作肠内病原菌培养。经培养志贺氏菌阳性的儿童进入本研究。入选病例基于下述标准：（１）年龄１２～５９个月；（２）中度营养不良；（３）腹泻持续０～５ｄ；（４）粪便标本经培养确认为志贺氏菌属的某些种（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ）。体重和身长（身高）测量采用国家卫生统计中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）的生长发育百分曲线。年龄别身高、年龄别体重和身高别体重评分计算采用ＰＣＴＬ９Ｚ人体测量学子程序（Ａｎｔｈｒｏｐｏｍｅｔｒｙ Ｓｕｂｒｏｕｔｉｎｅ）（疾病控制与预防中心，健康促进和教育中心，亚特兰大）。病例排除标准：（１）６个月前感染风疹；（２）现患全身性疾病如肺炎、脑膜炎、败血症、类白血病反应、溶血性尿毒综合征等；（３）服用锌补充剂；（４）严重的营养不良；（５）住所离临床研究服务中心的路程超过２ｈ；（６）拒绝参加。所有登记入选病例均根据ＩＣＤＤＲ，Ｂ伦理评审委员会的各条款与其监护人签署知情同意书。
１．２ 研究设计
本研究为一项双盲、安慰剂对照研究，全部病例被随机分成２个治疗组。利用随机排列表将病例分配到下列两个组中（两组例数相等）：治疗组，给醋酸锌和多维生素糖浆；对照组，仅给多维生素糖浆。双盲操作按标有数字的相同糖浆瓶来完成，按照每组内儿童的序列号将这些数字按编码顺序分发给儿童。治疗组的糖浆含有锌和多种维生素，在浓度、外观和口感上均与仅含多种维生素的对照组糖浆无法区别。
微量营养素补充剂由孟加拉国达卡Ａｃｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ提供。每５ｍｌ多种维生素（多维）糖浆含：ＶｉｔＡ３０００ＩＵ；ＶｉｔＤ６００ＩＵ；硫胺素，１．２ｍｇ；核黄素，２．０ｍｇ；尼克酰胺，６．０ｍｇ；泛酸钙，６．０ｍｇ。锌制剂含醋酸锌（２０ｍｇ元素锌５ｍｌ），混合在多维糖浆中。实验组从进入研究开始每日分两次服用含锌多维糖浆（维生素剂量为ＲＤＡ的２倍），共持续２周。对照组仅服用多维糖浆（维生素剂量为ＲＤＡ的２倍）。所有患者接受５ｄ的６０ｍｇ吡氨青霉素ｋｇ·ｂｗ·ｄ（分４次）治疗。两组患者的腹泻症状在３～５ｄ内缓解。住院期间所有进入本研究的儿童均按照１２０ｋｃａｌ和蛋白质３～４ｇｋｇ·ｂｗ·ｄ的膳食标准供给食物。膳食提供锌约为７～８ｍｇｄ。患儿住院期间由健康助手负责给这些儿童的喂服补充剂。在第７天，患儿出院后，由患儿母亲在家中按要求给患儿喂服补充剂７ｄ。第１４天，由一名健康助手对患儿进行家访，测量糖浆的服用量，并询问母亲在给患儿喂服补充剂时遇到的问题。
１．３ 样品采集
分别在进入研究时（第１天，补锌前）、第７天和第３０天（研究结束后患儿回医院回访取样时）采集每一位患儿的静脉血样。血标本收集于瓶壁涂覆肝素的灭菌小瓶内（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）。外周血单核细胞用Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度梯度离心ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｊｏｈｎ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｉｄｅｎ２５ｍｉｎ（９３９×ｇ，２５℃）从肝素抗凝的血样梯度离心的上清液中分离收集血浆，存于－７０℃待分析测定。还将血样收集于无微量元素污染的小瓶内，并将血清与细胞分离开。粪便标本分别采集于患儿进入研究的当日和回访日，粪便浸出物的提取参考文献方法１，并保存于－７０℃，待测。
１．４ 锌水平和Ｃ反应蛋白
血清锌浓度用火焰原子吸收分光光度计（ＢＤＨ）和锌标准液（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｏｌ；ＢＤＨ）测定。血清Ｃ反应蛋白浓度用荧光偏振免疫分析技术在Ａｂｂｏｔ ＴＤｘ分析仪上测定。
１．５ 血浆和粪便浸出物内的抗原特异性
抗体的测定
用酶联免疫吸附实验检测血浆ＩｇＧ和ＩｇＡ抗体，以及粪便浸出物内的ＩｇＡ抗体。本研究所用抗原为来自弗氏志贺菌Ｙ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ Ｙ）的脂多糖（ＬＰＳ）和来自ＳＰ１０株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株——侵袭质粒的宿主，并富含ＩＰａ）的侵袭性质粒编码蛋白抗原（ＩＰａ），抗原提取和纯化参照文献所述２。微量滴定板表面涂覆纯化ＬＰＳ（１０μｇｍｌ，加入到含０．１ｍｍｏｌＬ的ＮａＨＣＯ３和５ｍｍｏｌＬ ＭｇＣＬ２的碳酸盐缓冲液中）或ＩＰａ２０μｇｍｌ 加入磷酸盐缓冲液内，ｐＨ ７．４。４５０ｎｍ测定吸收情况。抗原特异性应答用相对滴度表示，即用样本的稀释因子确定吸收倍数。
１．６ 粪便浸出物分泌型ＩｇＡ浓度
用酶联免疫吸附实验测定粪便浸出物内总分泌型ＩｇＡ浓度，以已知ＩｇＡ浓度（１ｍｇｍｌ）的混合人乳作为标准。微量滴定板表覆抗分泌组分（１∶２０００，碳酸盐缓冲液，１００μｌ孔；Ｄａｋｏｐａｔｔｓ ＡＢ，丹麦），结合辣根过氧化物酶的抗分泌组分（１∶１０００；Ｄａｋｏ）作为结合物，滴定板用原苯二胺（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）作为底物显影。
１．７ 粪样和尿样内可溶性固有介质的测量
通过在６５０ｎｍ下，用动态分光光度计测定氢过氧化物依赖的３，３’，５，５’四甲基对二氨基联苯氧化来测定粪样浸出物内的髓过氧化物酶（ＭＰＯＥＣ １．１１．１．７）的活性。ＭＰＯ特异性活性单位以Ｕｍｇ总蛋白表示。用试剂盒（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）测定粪样中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ：ＥＣ１．１５．１．１）的活性。测定基于ＳＯＤ能增加５６６ａ．１１ｂ四氢３９１０三羟基苯芴（５６６ａ．１１ｂｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ３９１０ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｆｌｕｏｒｅｎｅ）在碱性水溶液中自动氧化率，并产生在５２５ｎｍ有最大吸收峰的发色基团。在５２５ｎｍ的每分钟吸收变化率定义为１Ｕ的酶活性单位。样品内ＳＯＤ特异性活力表示为Ｕｍｇ总蛋白。体内ＮＯ的终产物为硝酸盐和亚硝酸盐。用试剂盒（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）测定这些代谢产物的浓度来定量检测尿样中的ＮＯ的产量。测定了尿肌酐含量，以硝酸盐和亚硝酸盐与肌酐浓度比值表示各自的总浓度，并反映了体内ＮＯ代谢产物浓度。细胞因子ＩＦＮγ、ＩＬ１β和ＩＬ２用夹心酶联免疫吸附测定试剂盒测定。表达单位为ｐｇｍｌ粪样。该试剂盒对细胞因子的检测限分别为ＩＬ１β１ｐｇｍｌ ＩＦＮγ８ ｐｇｍｌ；ＩＬ２７ ｐｇｍｌ。
１．８ 淋巴细胞增殖检测
在无菌、９６孔Ｕ形培养板中，在５％ＣＯ２、３７℃下，外周血单核细胞（１×１０６ｃｅｌｌｓｍｌ）以单纯培养基或加入植物血凝素（ＰＨＡ，２μｌ孔；Ｇｉｂｃｏ）培养３ｄ。收集前用３Ｈ胸腺嘧啶５ｍＣｉｍｍｏｌ特异性活性，０．５μＣｉ孔；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈＵＫ脉冲１８ｈ。标记的细胞用细胞收集器（Ａｕｔｏｍｅｓｈ ２０００ＤｙｎａｔｅｃｈＤｅｎｋｅｎｄｏｒｆＧｅｒｍａｎｙ）收集于玻璃纤维滤纸上，结合３Ｈ胸腺嘧啶的淋巴细胞用β计数器（ＬＳ ６５００Ｂｅｃｋｍａｎ）计细胞个数（脉冲数／分钟）。每一位病例的测定结果以３次测定的平均刺激指数（激活细胞脉冲数／分钟与未激活细胞脉冲数／分钟的比值）表示。
１．９ 细胞培养悬液内细胞因子测定
外周血单核细胞培养同前所述。收集未激活细胞和ＰＨＡ激活细胞的培养上清液，用夹心酶联免疫吸附测定试剂盒测定上清液中的ＩＦＮγ和ＩＬ２。它们的浓度以ｐｇｍｌ上清液表示。
１．１０ 统计分析
用ＳＩＧＭＡＳＴＡＴ２．０３Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ，Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ 软件作统计分析。所有数据以几何均数±ＳＥＭｓ表示。以两因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）检验病程和治疗间的交互作用；如交互作用有显著性，则运用ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙ程序。对非正态分布数据，用ＡＮＯＶＡ秩和检验。组内（第１、第７和第３０天之间）比较用单因素方差分析检验。
２ 结果
２．１ 患者的人口统计学特征
共有５６个患儿参与本研究，年龄中位数为２３月龄（第２５～７５百分位数；１５～３０月龄）。所有病例（补锌组和对照组各２８例）均感染Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｓｐｐ。病例的基线特征见表１。补锌组与对照组基线特征无组间差异。进入研究当日对粪样镜检发现补锌组有３例、对照组有４例合并蛔虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）感染。这些儿童的临床恢复、生长发育和发病情况另见报道。
２．２ 锌水平和急性期反应
补锌组和对照组基线血清锌浓度无显著性差异。经两因素方差分析未见显著性的病程－治疗交互作用。在恢复期，补锌组和对照组患儿的血锌含量均有升高。然而，补锌（Ｐ＝０．０１）和时间（Ｐ＝０．００１）均能明显影响血锌的浓度见表２。对血清Ｃ反应蛋白浓度的影响上，补锌和病程之间无显著性的交互作用。而病程则能明显影响血清Ｃ反应蛋白浓度（Ｐ＝０．００１）。
２．３ 先天性体液免疫和炎症反应
检测了两个组所有病例粪便浸出物内的细胞因子（ＩＬ２、ＩＦＮγ、ＩＬ１β）和体内介质（ＭＰＯ、ＳＯＤ和尿样ＮＯ代谢产物）。细胞因子和体内介质浓度均无明显组间差异，组内细胞因子和体内介质浓度随时间也无显著差异。时间仅对粪便ＩＬ１β浓度有影响（Ｐ＝０．００１）结果见表３。
２．４ 细胞免疫应答
分析测定了患儿的外周血单核细胞受促有丝分裂剂（ＰＨＡ）刺激后增生（结合３Ｈ胸腺嘧啶）和产生细胞因子的反应能力。补锌和病程之间的交互作用经两因素方差分析无统计学意义；然而，服用锌补充剂２周后，对刺激指数有明显影响Ｐ＝０．００２见表４。ＰＨＡ激发后ＩＦＮγ和ＩＬ２的分泌无显著性组间差异，且随病程延长，组内差异也无统计学意义。
２．５ 抗原特性抗体反应
用ＬＰＳ和Ｉｐａ作抗原来检测患儿对志贺菌特异性抗原的免疫应答。经两因素方差分析发现病程和治疗（补锌）之间存在显著的组间差异（Ｐ＜０．００３）。Ｐｏｓｔ ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ’ｔｅｓｔ发现补锌组从第１天起到第３０天较对照组的Ｉｐａ特异性ＩｇＧ应答显著升高（Ｐ＜０．００１）。两个组第３０天的Ｉｐａ特异性ＩｇＧ应答显著高于第１天或第７天（Ｐ＜０．００１）见表５。除病程对血浆ＬＰＳ特异性ＩｇＡ（Ｐ＝０．０２６）和粪ｓＩｇＡＰ＝０．０１２有明显影响外，组间或组内未见病程对其它抗原特异性抗体有统计学意义的影响。
３ 讨论
本研究结果表明对志贺氏菌痢患者急性期内短时间补充锌能够改善志贺氏菌抗原特异性ＩｇＧ应答和淋巴细胞增殖反应。感染时血锌浓度下降是机体的一种急性期反应，经临床痊愈后血锌又会恢复到基线值。然而，补锌组相对于对照组血锌有显著升高，提示这些患儿在家中可能存在膳食锌摄入不足，因而在菌痢的急性反应期内服用１４ｄ的锌补充剂造成了显著差异。与本研究相符的另一早期研究发现，与对照组儿童的线性生长相比，急性腹泻期接受１４ｄ锌补充剂的患儿，４～９周增加了２５％。
志贺氏菌痢是一种伴随前炎性细胞因子和介质如ＭＰＯ、ＮＯ和类二十烷（ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ）过度产生的急性炎性疾病。已知锌能够保护细胞免受免疫激活时产生的活性氧簇介导的损伤，维持细胞膜的完整。锌通过减少ＭＰＯ浓度来减弱炎症反应，已有报道锌对Ｃｒｏｈｎ病模型大鼠有治疗效应。内源性锌能抑制小肠内ＬＰＳ和ＩＬ１β诱导的ＮＯ形成和炎症反应。锌在体外还可作为ＮＯ的清除剂。然而，本研究中，我们没有观察到锌对细胞因子、ＭＰＯ和ＮＯ代谢产物浓度的显著影响。
对幼儿３～４个月每日长期补锌能够改善其细胞免疫。补锌儿童的皮肤迟发型超敏反应、淋巴细胞对ＰＨＡ的增生反应和淋巴细胞亚群比例等细胞免疫状态都得到改善。本研究中，为期１４ｄ的补锌增强了淋巴细胞对ＰＨＡ的增生反应。尽管体外实验表明细胞外锌能够诱导单核细胞产生ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＦＮγ和ＴＮＦα，诱导Ｔｃｅｌｌ产生ＩＬ２和ＩＦＮγ，然而，在改善淋巴细胞功能方面，如对ＰＨＡ激活应答后细胞因子的分泌不明显。可能是由于体内和体外的细胞活化过程不同。
为确定补锌对志贺菌抗原特异性免疫应答的作用，我们检测了血浆和粪样内的ＬＰＳ和Ｉｐａ特异性ＩｇＡ和ＩｇＧ抗体含量。与对照组比较，补锌组患儿的Ｉｐａ特异性ＩｇＧ从第１天到第３０天有显著升高，提示补锌可能促进了机体回忆型记忆应答的上升。事实上，志贺氏菌痢患儿如果伴有营养不良，其免疫应答的加强会减弱。而且，与成人不同的是，小儿志贺氏菌痢患者降低和延迟了适应性免疫应答，因而，补锌可能有增强特异性免疫应答的附加效应。最近的一项对孟加拉国儿童（４９％的儿童血锌≤６０ｍｇｄｌ）口服霍乱疫苗研究结果显示补充锌４２ｄ后，机体的免疫应答得到改善。另一研究报道了补锌１个月后促进的老年患者对破伤风疫苗的ＩｇＧ应答。仅有一项研究显示血清锌浓度降低和对白喉疫苗不应答有直接相关性。然而，多数对锌缺乏患者长期补锌的疫苗接种研究并未显示抗疫苗抗体滴度有任何上升。再者，给不缺锌的健康成人补锌能使血清对口服灭活全细胞霍乱疫苗抗弧菌反应明显升高，并且淋巴细胞对有丝分裂原的反应也升高，而对机体的有益效应并非是由于补锌校正了潜在的锌缺乏。动物实验发现，缺锌对骨髓Ｂ淋巴细胞的形成、体外抗体的产生和免疫球蛋白同型转换有不利影响，并且Ｔ细胞依赖性抗体应答比非Ｔ细胞依赖性抗体应答受到缺锌的影响更严重。志贺菌的ＬＰＳ是一种非Ｔ细胞依赖性抗原；同时因为Ｉｐａ是一种蛋白质，即是一种Ｔ细胞依赖性抗原。这就可以解释补锌对血浆的Ｉｐａ特异性反应的影响效应。
总之，本研究的结果表明急性志贺氏菌痢期间为期２周的每日２０ｍｇ元素锌补充增强了外周循环抗原特异性抗体和淋巴细胞增生等免疫应答。资料表明，不用长期补锌，而用短期补锌作为常见传染病的一项辅助治疗措施可能同样有助于促进免疫应答。在欠发达国家，微量营养素缺乏普遍存在，从公共卫生角度看，短期补锌可能是一项有效的、切实可行的和低成本的治疗措施。
参考文献：
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译自：Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００４，７９∶４４４－４５０ | 