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Ｎａｍａｎ ｊｅｅｔ Ａｈｌｕｗａｌｉａ，Ｊｉａｎｑｉｎ Ｓｕｎ，Ｄｅａｎｎａ Ｋｒａｕｓｅ，Ａｎｄｒｅａ Ｍａｓｔｒｏ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｈａｎｄｔｅ 薛 琨 王 劲译
摘要：背景 衰老常常伴随免疫功能失调。铁缺乏可进一步损害老年人的免疫力。已发表的报道中关于铁缺乏和人体免疫应答的关系并不一致。大部分研究关注发展中国家的幼儿，并且常常混杂有其它疾病状况、感染及营养素缺乏等因素。目的 我们的目的是为了确定居家老年妇女铁营养状况与免疫功能的关系，这些老年妇女常常同时有铁营养状况和免疫反应的损害。根据严格的排除标准选择研究对象，如排除患病、感染和缺乏影响免疫力的主要营养素。方法 ７２名居家老年女性提供血样，用以全面评价铁营养状况和细胞免疫，先天性免疫状况。研究对象根据多项铁营养状况异常测试结果分为铁缺乏和铁充足两组，分别比较两组之间的淋巴细胞分类、吞噬作用、突发性氧化能力和有丝分裂原激发的Ｔ细胞增殖。结果 在铁缺乏女性中，伴刀豆球蛋白Ａ和植物凝集素Ａ激发的Ｔ细胞增殖只有铁充足女性的４０％～５０％。两组间吞噬作用没有明显差别，但铁缺乏女性突发性呼吸明显比铁充足组低２８％。结论 铁缺乏与细胞免疫和先天性免疫损伤有关，并使老年人更容易发生感染。还需要进一步的前瞻性研究来同时检验铁缺乏对免疫反应和发病率的影响，并用类似的排除标准，即患病、感染和伴随营养素缺乏。
关键词：铁营养状况；细胞免疫；吞噬作用；突发性氧化能力；老年妇女
良好的营养对维持免疫非常重要。衰老常常与免疫能力的下降相关联，尤其是Ｔ细胞介导的免疫功能。营养素缺乏可进一步造成老年人免疫功能下降，并使他们比营养素充足者更容易罹患急慢性感染和疾病。不少研究着眼于不同营养素在维持老年女性免疫功能中的作用。但铁缺乏对老年女性免疫反应的作用还没有得到充分验证，仅发现在体弱的、居家的或托养于专门机构的老年人中铁缺乏的现患率相当高。在一项关于托养机构的老年人营养状况与对流感疫苗反应的研究中，Ｆｕｌｏｐ等报道对疫苗无反应的人群中，血红蛋白、红细胞容积和血清铁浓度明显低于对疫苗有反应人群，提示老年人铁缺乏可能存在细胞免疫反应低下。
人类铁营养状况与免疫功能的关系最初是在婴幼儿、成年人的研究中提出来的，细胞免疫损伤（ＣＭＩ）和杀菌功能低下常见于铁缺乏人群：但观察到的结果并不一致。就铁缺乏和免疫力的矛盾结果可能与研究对象的年龄、存在炎症或共存其它营养素缺乏、应用的铁缺乏的定义不同、或不同研究所用的免疫功能评价方法不同有关。因此我们的兴趣在于全面确定居家老年女性铁营养状况与细胞免疫、自然免疫损伤程度的关系，这部分人群处于发生铁缺乏的危险中；用严格的筛选标准调整了健康不良、炎症和其他营养素缺乏等混杂因素的影响。
对象和方法
对象
根据宾夕法尼亚３个乡村（ＢＬＡＩＲ、ＣＥＮＴＲＥ、ＣＬＥＡＲＦＩＥＬＤ）老人院的医疗记录确定居家老年女性（＞６０岁，ｎ＝２２５），均接受来自老人院的餐饮或日常生活活动等服务，并没有已知影响免疫应答的慢性病。通过参加本研究的传单或邀请信联系研究对象，其中１１９名妇女表示对参加本研究感兴趣。根据ＳＥＮＩＥＵＲ 协议的原则，需要获得被联系妇女的口头病史，以排除任何慢性病或急慢性感染和当前使用任何影响免疫应答的药物。８０名女性符合该协议的健康标准，其中７２名同意提供血样并参加本研究。没有人在进入本研究前３个月中常规服用过铁补充剂。对象根据由宾夕法尼亚州立大学守法办（Ｏｆｆｉｃｅ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）批准的协议签订了知情同意书。对象在完成研究后收到５０美元作为酬谢。
研究协议
表面健康的、居家女性（７２名），在家中休息１５ｍｉｎ后提供空腹血样。用便携式标准化仪器记录身高、体重，并且根据ＳＥＮＩＥＵＲ协议排除体质指数（ｋｇｍ２）＜２０的女性。由有资格证书的放血医生收集静脉血（约３５ｍｌ）放入装有肝素、ＥＤＴＡ、或没有添加物（无微量元素试管）的３种清洗干净的试管中，用实验室检测来筛查健康和营养状况。
健康筛查
在Ｃｏｕｌｔｅｒ ＭＡＸＭ 分析仪上进行全血细胞计数和细胞分类。用罗氏Ｍｉｒａ ｐｌｕｓ ｒａｎｄｏｍａｃｃｅｓｓ 化学分析仪进行临床化学健康检查。这些检测的结果由医生评价排除感染、炎症、肝病、肾病、骨髓增殖异常或这些病的其他合并症，４名对象被排除。
为了评价炎症状况，用Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ法检测了红细胞沉降率。用放射免疫扩散法测定血清α酸性糖蛋白。白细胞计数升高也被作为炎症状况的指标。异常结果的界值为：红细胞沉降率＞３０ｍｍｈ，白细胞计数＞１１×１０３ｍｍ３，α酸性糖蛋白＞１．４ｇＬ。３项炎症检测结果出现两项以上异常者从分析中排除（ｎ＝３）。
营养状况筛查标准
实验室检测以确定蛋白质、维生素Ｂ１２、叶酸、锌是否充足，因为这些营养素缺乏与免疫反应低下有关。检测血清总蛋白和血清白蛋白浓度反映部分临床化学特征。用商业放射分析试剂盒测定了维生素Ｂ１２、叶酸浓度。用原子吸收分光光度法测定血浆锌。
两名血清总蛋白浓度＜６０ｇＬ，血清白蛋白＜３５ｇＬ或兼有两种情况的对象从分析中排除。为了排除存在维生素Ｂ１２或叶酸缺乏的人，两名血清维生素Ｂ１２浓度２５０ｎｇＬ，血清叶酸浓度＜２μｇＬ，或平均细胞体积＞１０２ｆＬ的对象从分析中被排除。没有人存在锌不足（血浆锌＜６００μｇＬ）。两名妇女的血样不够完成所有的筛查和免疫功能测试，不得不从分析中排除。
铁营养状况的检测以及铁充足或铁缺乏的特征
进入研究的７２名女性中，５９名符合入选标准，通过一系列实验室检测项目对她们进行了全面的铁营养状况评价。血清铁蛋白用放射免疫试剂盒测定。血清转铁蛋白受体用酶联放射免疫分析试剂盒测定。血清铁、总铁结合力和转铁蛋白饱和度用美国医学实验室的比色法测定。血红蛋白、红细胞容积和其他红细胞指标通过ＣＢＣ分析获得。铁储存耗竭和铁营养状况异常测试结果≥两项的女性被认定为是铁缺乏。
免疫功能
考虑到血样量，根据以前建立的、在我们实验室生效的方案，用全血测定免疫功能指标。
淋巴细胞表型
在１ｍｌ肝素处理的血样中，用流式细胞仪和对表面抗原有特异性的、荧光标记单克隆抗体对淋巴细胞进行分类估计。比如，抗ＣＤ３识别总Ｔ细胞，抗ＣＤ４识别总辅助Ｔ细胞，抗ＣＤ８识别总细胞毒Ｔ细胞，抗ＣＤ５６、１６识别ＮＫ细胞，抗ＣＤ１９识别Ｂ细胞。通过分类估计ＣＢＣ获得总淋巴细胞数，总淋巴细胞数用来计算不同淋巴细胞亚群的绝对数。
有丝分裂原激发的Ｔ细胞增殖
通过测量３Ｈ胸腺嘧啶的结合６．７Ｃｉｍｍｏｌ，得到不同浓度的植物红细胞凝集素（ＰＨＡ）和伴刀豆球蛋白Ａ（Ｃｏｎ Ａ）引起的Ｔ细胞增殖。基于我们先前的研究，ＰＨＡ和ＣｏｎＡ浓度分别是５ｍｇＬ和１０ｍｇＬ以及３ｍｇＬ、１２ｍｇＬ和２５ｍｇＬ。肝素处理的血样以１∶１０的比例用ＲＰＭＩ １６４０稀释，其中包含１０％胎牛血清、Ｌ谷氨酸盐２ｍｍｏｌＬ、青霉素１００ ０００ＵＬ和链霉素１００ｍｇＬ。在９６孔的圆底微量滴定板上，每孔加入稀释的血样和有丝分裂原每孔１００μＬ。对于每个浓度的有丝分裂原，每个对象做６个平行样。细胞孵育４２ｈ（湿润，５％ＣＯ２，３７℃）然后在每个小孔中加入１０μＬ３Ｈ胸腺嘧啶。之后，细胞再孵育６ｈ，然后用玻璃纤维滤膜（Ｓｋａｔｒｏｎ ７０２５ Ｃｏｍｂｉ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ Ｓｋａｔｒｏｎ公司 Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）收集细胞。用 Ｗａｌｌａｃ １２０５ Ｂｅｔａ 板式计数器（ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ 公司 Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ ＭＤ）测定掺入到细胞ＤＮＡ中的３Ｈ胸腺嘧啶。将血液中Ｔ 细胞浓度标准化后，并用每１０００个Ｔ 细胞来表示结果。
吞噬细胞、吞噬作用、突发性氧化能力
单核细胞可以通过流式细胞仪用对表面抗原有特异性的荧光标记单克隆抗体检测例如，抗ＣＤ１４识别单核细胞。用ＣＢＣ通过分类计数得到的总的淋巴细胞数量，可以用来计算单核细胞的绝对数量。粒细胞的数量也用ＣＢＣ通过分类计数获取。
吞噬作用用流式细胞仪和试剂盒测定。肝素处理的血样与异硫氰酸荧光素标记的、经调理素作用的大肠杆菌在３７℃下孵化１０ｍｉｎ，然后将未被摄取细菌的荧光猝灭。用ＥＰＩＣＳ ＸＬ流式细胞仪测定含荧光的粒细胞（即表现出吞噬作用）的百分比和每个细胞的平均荧光强度（也就是每个粒细胞吞噬的细菌数量）。
也测定了粒细胞的爆发性氧化能力，用来间接测定杀菌功能。肝素处理的血样与大肠杆菌在３７℃孵育１０ｍｉｎ，然后加入二氢罗得明１２３（ＤＨＲ １２３），该物质可与氧化爆发中生成的氧体系反应而产生荧光。用流式细胞仪测定荧光性粒细胞百分比（表现出爆发性氧化的细胞）和每个细胞中的荧光强度（每个粒细胞的爆发性氧化程度）。
统计分析
用ＷＩＮＤＯＷＳ版的ＳＡＳ软件（８．１）进行统计分析。所有变量的分布先进行正态性检验。体质指数ＢＭＩ、血清铁蛋白浓度、白细胞分类、ＰＨＡ和ＣｏｎＡ激发的淋巴细胞增殖反应数据经对数转换符合正态分布后进行统计分析。
根据前面所述的铁营养状况评价标准，５９名没有炎症和营养缺乏的健康女性被分为两组：铁缺乏组（年龄７６．１±６．６，ｎ＝１２）和铁充足组（年龄：７６．９±５．５，ｎ＝４７）。两组女性间关于营养状况变量和炎症检测的数据差异性首先用Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ检验进行判断。用方差分析检验所有测定的免疫功能变量在两组间的差异。所有分析的显著性水平设定为Ｐ＜０．０５。
结果
根据所用的筛选标准，认为所有进入分析的对象是健康、没有感染、一般营养状况良好的（表１）。铁缺乏组和铁充足组的营养状况和炎症检测的结果都在正常范围，并且所有变量在两组间没有显著性差异（表１）。与预计的一样，铁缺乏组的铁营养状况显著低于铁充足组（表２）。铁缺乏组所有机体铁参数的值显著低于铁充足组（Ｐ＜０．０５），即存储铁（较低的血清铁蛋白）、组织铁（增加的转铁蛋白受体）、转运铁（较低的血清铁和转铁蛋白浓度）、和红细胞铁（较低的血红蛋白和红细胞容积）。大约一半的铁缺乏对象处于贫血状态，其余的处于红细胞生成缺铁期。两组间的淋巴细胞总数和分类（粒细胞和单核细胞）用绝对数量和百分比表示时没有显著性差异（Ｐ＞０．１０没有列出数据），两组的这些数值均在正常范围内下降，并且与以往报道的结果相似。不同浓度ＰＨＡ和ＣｏｎＡ激发的淋巴细胞增殖反应在铁缺乏组女性中显著低于铁充足组的女性（表３）。吞噬作用，即粒细胞吞入大肠杆菌的程度在两种铁营养状况下没有显著差异。吞噬大肠杆菌、表现出呼吸爆发的粒细胞数，在铁缺乏组和铁充足组之间没有显著性差异。但铁缺乏组女性粒细胞表现出的呼吸爆发的幅度显著低于（２８％）铁充足组的女性，可能提示铁缺乏组的杀菌能力下降（表４）。
讨论
在生化和细胞水平，铁维持免疫反应中的作用被认为非常重要。例如，铁是核糖核苷酸还原酶的组成部分，该酶涉及ＤＮＡ生成和细胞分裂；并且铁对于中性粒细胞杀灭细菌过程中的髓过氧化物酶活性所必需。铁对蛋白激酶Ｃ的活化也有重要作用，蛋白激酶Ｃ可以磷酸化各种调节细胞增殖的因子。有关人类铁缺乏与免疫失调的报告常常存在其他营养素缺乏、亚临床感染或炎症等混杂因素，这会干扰铁营养状况和免疫功能的检测。很少研究在考虑了这些潜在的混杂因素后验证铁缺乏对免疫功能的作用，而且这样研究的结果是混淆的。因此，我们周密地设计了研究，首先排除存在的混杂因素（炎症和其他营养素缺乏），然后检验免疫功能在铁缺乏组和铁充足组老年妇女之间的差异。我们没有使用基于分离的单核细胞分析，而是采用了经我们实验室确认的全血分析。全血分析的好处在于用血量少，血样制备简单，并与体内状况最为接近。
我们考察老年群组的铁营养状况和免疫反应的关系有几个原因。铁缺乏在居家或在养老机构居住的老人中非常普遍。再者，尽管这部分人群因为年龄关系，某些Ｔ细胞功能衰退，存在可能已经使免疫系统受到损伤的事实，但还没有关于老年人铁营养状况和免疫力关系的研究。
大部分以往的研究提示铁缺乏可能对自然免疫和Ｔ细胞介导功能比对体液免疫有更大影响；所以我们在本研究中着眼于这些方面。铁缺乏界定为存在储存铁耗竭和在包括组织铁缺乏到贫血的全系列检测中有两项以上异常结果。
这项周密设计的横断面研究中，排除了疾病、炎症、蛋白质、维生素Ｂ１２、叶酸、锌等可能影响免疫功能的关键营养素缺乏等混杂因素，结果提示，铁缺乏与细胞免疫和自然免疫的显著损害相关联。
有趣的是在现在的研究中，淋巴细胞和分类，粒细胞、单核细胞的绝对数量和百分比（数据未列出）在铁缺乏组和铁充足组之间没有显著差异，与Ｔｈｉｂａｕｌｔ等的发现一致。而其他有报道提出铁缺乏的儿童和成年人淋巴细胞计数减少。也有人报道在铁缺乏贫血人群中存在Ｔ细胞或辅助Ｔ细胞减少。结果不同可部分解释为研究中同时患有其他疾病、感染、其他营养素缺乏等影响因素，或者测定淋巴细胞分类的方法不同，或研究对象铁缺乏的程度不同。
模仿体内Ｔ细胞对抗原的反应，将Ｔ淋巴细胞与有丝分裂原共同培养，其增殖能力在铁缺乏组女性中显著降低，铁缺乏组伴刀豆蛋白ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ激发的Ｔ细胞增殖是铁充足组的３８％（２５ｍｇＬ）～４６％（３ｍｇＬ），同样由植物血球凝集素ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ Ａ激发的Ｔ细胞增殖是铁充足组的４２％（５ｍｇＬ）～６０％（１０ｍｇＬ）（表３）。Ｔ细胞对有丝分裂原反应增殖能力这样大幅度的下降在以往铁缺乏儿童和成人的研究中也有过报道；然而，这些人群可能也存在其他营养素缺乏或亚临床感染。有趣的是有两项检测了叶酸和维生素Ｂ１２的研究报道了相反的结果，这些研究还需要进一步的讨论。Ｋｕｌｐｏｎｇｓ等的研究中，样本量较小，只有８名严重铁缺乏但不缺叶酸和维生素Ｂ１２的泰国儿童，没有观察到他们存在ＰＨＡ激发的Ｔ细胞增殖反应下降。Ｇｒｏｓｓ等在非洲所进行的研究中铁缺乏人数也只有５人。这两项研究人群中蛋白质、锌营养状况可能偏低，但没有提供整个人群或对照人群关于这两种营养素营养状况的详细资料，使他们的结果难以解释。
考察过成人噬菌作用和杀菌作用的研究很少。本研究中，噬菌作用在铁缺乏组和铁充足组女性之间没有显著差异：这与以往有关儿童的研究结果相一致。我们关于氧化爆发降低的发现也与在发展中国家儿童中做的调查结果相一致，但这些研究人群中也可能存在其他亚临床营养素的缺乏或感染。在Ｋｕｌｐｏｎｇｓ等的小样本调查中，应用了更严格的设计以确保叶酸和维生素Ｂ１２充足，但没有发现杀菌活性在铁缺乏儿童（８名）和铁充足儿童（２０名）间有显著差异。蛋白质和锌营养状况可能是这些研究中的混杂因素，但这些作者没有提供有关的详细资料。我们的研究结果提示了粒细胞呼吸爆发能降低可能使铁缺乏老年人增加感染的风险。这种推测与我们在斯里兰卡儿童中进行的随机对照研究结果相一致，通过补铁提高铁营养水平，使得上呼吸道感染的发病率降低，病程缩短。
本研究的说服力在于：设计中排除了存在疾病、炎症和潜在营养素不足的对象（例如营养不良和缺乏蛋白质、维生素Ｂ１２、叶酸或锌），根据缺铁各阶段的指标检查对铁营养状况进行了全面评价，对细胞介导免疫和自然免疫的全面评价。但因为本研究是横断面调查的性质，只能说明事物间的相关性。要确定铁缺乏和免疫反应之间是否存在因果关系还需要进一步的实验研究。而且，铁缺乏的原因，包括膳食摄入、胃酸缺乏，和出血等情况应该在进一步的调查中考查。我们正在进行一项研究，调查补充铁剂对铁缺乏老年女性免疫功能的作用。
总之，用严格标准保证研究对象不存在潜在疾病、感染、炎症和可能影响免疫功能的关键营养素缺乏，本次横断面调查表明老年女性铁营养状况不良与自然免疫和细胞免疫ＣＭＩ检测指标的下降存在明确的相关关系。这些发现有公共卫生意义，而且强调了诊断、治疗、预防铁缺乏的重要性。本研究提示铁缺乏人群免疫功能下降，可能增加感染的流行。用类似的严格的研究对象筛选程序做进一步的实验性研究，应该同时考察铁营养状况与免疫功能和感染的关系。
译自：Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００４ ７９５１６－５２１ | 