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摘要目的：研究视黄酸(RA)促进脐血淋巴细胞(CBL)抗体生成的作用机制。方法：对脐血标本进行血清维生素A浓度测定，采用RT-PCR法检测CBL中视黄酸受体-a(RAR-a)的基因表达水平，并采用ELISA法检测细胞培养上清液中lgM含量。结果：脐血血清维生素A水平与未培养CBL中RAR-a的基因表达水平之间存在正相关：r=0.50(P<0.01)；RA增加SAC活化CBL的IgM生成能力(P<0.001)：RA上调SAC活化CBL中RAR-a的基因表达水平(P<0.001)；RA使RAR-a基因表达的上调幅度与RA使IgM生成的上调幅度之间存在正相关：r=0.40(P<0.05)。结论：RA对CBL抗体生成的促进作用可能通过RAR-a途径传递。
关键词：视黄酸受体 基因表达 脐血淋巴细胞 抗体生成中图分类号：R151.2
近年来的研究已证实维生素A对免疫系统，对T、B淋巴细胞功能具有调节作用[1]。维生素A的主要活性产物视黄酸能促进体外培养的脐血单核细胞产生免疫球蛋白[2]，但其作用途径和机制有待进一步阐明。为此，我们测定分析了脐血血清维生素A水平，并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测分析RA对脐血淋巴细胞(CBL)中视黄酸受体-a（RAR-a)基因表达水平的调节，以探讨RA对脐血淋巴细胞抗体生成能力的促进作用是否通过RAR-a调节的途径。
1 材料与方法
1.1脐血血清维生素A测定
脐血获自上海市金山区金卫乡卫生院母婴健康且营养状态良好的顺产儿，本文参考刘继鹏等[3]的方法，采用微量荧光分光光度法测定脐血血清维生素A浓度。
1.2淋巴细胞体外培养
脐血分离单核细胞后，用含15%小牛血清(GIBCO产品)的RPMI 1640培养液(GIBCO产品)悬浮细胞为每毫升106个，培养在96孔U型板中，加入SAC(CALBIOCHEM产品)，浓度为1×10-6mol/L，在培养24h后收获细胞，留置未培养的单核细胞作为对照。培养7d后收集细胞上清液进行IgM含量测定。
1.3 RT-PCR检测RAR-a mRNA
总RNA抽提：培养前后的脐血淋巴细胞采用TRIzol试剂(GIBCO产品)提取制备总RNA，用紫外分光光度计(日本岛津UV-1601)测定OD260进行准确定量。
引物设计：参考国外文献资料并采用计算机辅助设计，RAR-a的上下游引物分为5'-GCGGGCACCTCAATGGGTAC-3' 和5'-GGACATGCCCACTTCAAAGC-3'。引物由中科院上海生化所合成。
RT-PCR：取1mg总RNA经MMLV逆转录酶(GIBCO产品)催化合成cDNA第一链，并以此为模板进行PCR扩增，PCR反应体积为50m1，经30～35循环后，取扩增产物10m1走2％琼脂糖凝胶(含EB)电泳，在紫外灯下观察结果并照相(英国UVP公司紫外凝胶成像及分析仪).
1.4 细胞上清液中IgM含量的测定
采用ELISA双抗夹心法检测上清液中IgM含量。
1.5 结果分析与显著性检验
采用紫外凝胶成像及分析系统(英国UVP公司)对电泳凝胶中的PCR产物条带进行定量分析；配对资料比较的显著性检验采用配对t检验，直线相关系数的显著性检验根据r值直接查r界值表。
2 结果
2.1脐血血清维生素A水平及其与CBL中RAR-a基因表达水平的相关性
脐血血清维生素A水平的平均值为1.06±0.35mmol/L。对脐血血清维生素A水平与未培养CBL中RAR-a的基因表达水平之间作相关分析发现，两者之间存在显著正相关：r=0.50,Ｐ<0.01(图1)。
2.2 RA对体外培养CBL的IgM生成能力的促进作用
RA(1×10-6mol/L)增加SAC刺激的CBL的IgM生成能力，由0.44±0.36mg/L(SAC刺激)增加到1.20± 0.72mg/L(SAC + RA 共同培养)(g=6.096,P<0.001)(图2)。
2.3 RA对体外增养的CBL中RAR-a基因表达的调节
CBL在单纯SAC刺激培养24h后，RAR-a的mRNA水平为未培养时的1.21±0.18倍，加入RA与SAC共同培养24h后，CBL中RAR-a的mRNA水平增加至未培养时的1.45±0.22倍，RA对RAR-a mRNA水平的上调具有显著性意义(r=6.025,P<0.001)(图3)。
2.4 CBL中RAR-a基因表达水平与IgM合成水 平受RA上调幅度之间的相关性。 RA使RAR-a基因表达的上调幅度与RA使IgM生成的上调幅度之间存在正相关关系：r=0.40,P<0.05(图4)。
３ 讨论
自1913年维生素A被发现以来，人们就观察到维生素A具有抗感染作用。Scrimshaw[4]指出"和维生素A缺乏相比，没有一种其他营养素的缺乏与感染性疾病之间具有更密切的相关关系"。维生素A对T、B淋巴细胞的活化、增殖和分化具有重要的调节作用[1]。本次研究再次表明类维生素A的代表分子RA能够促进体外培养的CBL的IgM生成能力，但其作用途径和机制需进一步阐明。
1987年视黄酸受体(RARs)的发现[5]，大大促进并深化了对维生素A增强免疫功能的机制研究。视黄酸受体属于类固醇/甲状腺激素核内受体超家族成员，包括3种亚型：RAR－a、RAR-b和RAR－g,其中RAR-a在细胞中的表达最为广泛。Halevy和Friedman等[6,7]的研究发现类维生素A诱导小鸡/小鼠T淋巴细胞中RAR-a基因的表达，同时发现T细胞的增殖反应被增强。近几年来，本课题组的研究发现人外周血淋巴细胞中主要表达RAR-a，少量表达RAR-g，不表达RAR-b基因，而且RAR-a基因的转录表达受丝裂原和RA的调节,提示RAR-a可能参与RA对淋巴细胞的调节功能。
本次研究检测了30例脐血标本的血清维生素A水平，同时检测了未培养CBL中RAR-a的基因表达水平，并首次发现脐血血清维生素A水平越高，RAR-a的基因表达水平也越高，两者之间存在显著正相关。说明人体维生素A营养水平与RAR-a表达水平之间密切相关。
本次研究再次表明RA能够上调SAC活化CBL中RAR-a的基因表达，更为重要的是，我们发现RA使RAR-a基因表达的上调幅度与RA使IgM生成的上调幅度之间存在正相关关系。这些研究结果说明类维生素A水平、RAR-a基因表达水平和IgM生成之间存在密切关系，提示RA对CBL的IgM生成的促进作用可能通过RAR-a途径传递，RA可能通过上调RAR-a的表达进而促进CBL的抗体生成。
RAR-a是类维生素A依赖的转录因子，位于细胞核内基因转录的调控区，受其调节的基因有50余种，包括RAR-b、层粘蛋白B1、补体因子H和垂体生长激素等基因[9]。RAR-a可能在基因转录水平上直接调节免疫球蛋白基因的转录表达，也可能通过调节细胞因子等基因表达的间接途径而调节免疫球蛋白的生成。
儿童的免疫系统尚处于发育成熟阶段，由T、B淋巴细胞介导的细胞免疫和体液免疫功能尚待完善，这使儿童易患各种感染性疾病。儿童易发生维生素A缺乏，早产儿中更明显，这更不利于儿童的抗病免疫能力。最近Rahman等[10]对6月龄以内婴儿进行的维生素A补充试验发现。补充维生素A后血清维生素A水平达到正常的婴儿的细胞介导免疫功能显著优于安慰剂组，表明维生素A对于儿童免疫系统的发育和功能具有促进作用。进一步阐明类维生素A对T、B淋巴细胞功能的调节机制，将为在临床上使用类维生素A制剂，在儿童中开展维生素A补充干预试验，提供理论和实验依据。
参考文献
1. Richard S. The role of vitamin A and related retinoids in immune function. Nurtition Review, 1998;56:s38.
2. Wang W, Ballow M. The effects of retinoic acid on in vitro immunoglogulin synthesis by cord blood and adult peripheral blood mononuclear cells. Cell Immunol, 1993;148:291.
3. 刘继鹏，奚金宝，阎志等. 血清维生素A微量荧 光测定法的改进和应用.营养学报，1985;7:136.
4. Scrimshaw NS, et of. Interactions of Nutrition and Infection. Geneva: World Health Organization, 1968.
5. Martin P et al. A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptor. Nature, 1987;330:444.
6. Halevy O et al. Retinoic acid receptor-a gene expression is modulated by dietary vitamin A and by retinoic
*女，1971年出生，硕士研究生，本研究获国家自然科学基金资助，项目号：39470613
acid in chicken T lymphocytes. J Nutr,1994;124:2139.?7. Friedman A et al. Retinoic acid promotes prolifetation and induces expression of retinoic acid receptor- a genein murine T lymphocytes. Cellular Immunology, 1993;152:240.
8. 王卫平，杨毅，苏贻新.人外周血淋巴细胞视黄酸 受体基因的表达与调控.营养学报，1998;20:275
9. Yuichi Hashimoto. Retinobenzoic acids and nuclear retinoic acid receptors. Cell Structure and Function, 1991;16:113.
10. Rahman MM et al. Effect of early vitamin A supplementation of cell-mediated immunity in infants younger than 6 mo. Am J Clin Nutr, 1997;65:144. | 