学术报告厅
| The relativity of VA 、zinc status and the expression of HOX gene in rats' embryo | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
孙秀发 朱清华 刘恭平 杨丽琛 华中科技大学同济医学院营养与食品卫生研究室 武汉 430030 维生素A和锌是两种极为重要且我国居民膳食相对容易缺乏的微量营养素。研究发现，维生素A严重缺乏可导致胚胎一系列畸形（1），其原因与发育基因表达水平有关（2）。锌与体内数百种酶的结构和功能相关，有报道缺锌可致胚胎畸形，其机制是缺乏可影响染色质的结构和基因表达水平（1）。HOX基因是目前研究最多的胚胎发育控制基因。为了进一步揭示维生素A、锌的营养水平和胚胎发育的关系，本文着重研究了小鼠的不同维生素A、锌的营养水平与HOX C4（3.5）基因表达的相关性。 1、材料和方法 1.1动物分组及喂养 维生素A的研究 清洁级断乳昆明种小鼠（雌60只，雄30只），由武汉生物制品研究所动物中心提供。适应性喂养一周后，将雌鼠按体重随机分为3组，每组20只：维生素A缺乏组：自始至终以不含维生素A的饲料喂养；维生素A补充组：喂以上述维生素A缺乏饲料，直至受孕第7天开始更换含维生素A 10000IU?kg-1的饲料；正常组：始终喂以含维生素A 4000IU?kg-1的正常饲料。饲料配方按AOAC配方修改成。雄鼠饲以普通饲料。动物用不锈钢鼠笼喂养，自由摄食饮水，室温20℃～25℃，湿度为55％～65%。动物在实验第16周（维生素A缺乏症状明显时），按雌∶雄=2∶I合笼交配，清晨查阴栓，阳性者为受孕0天。受孕第12天时，眼眶取血后，脱颈椎处死，取出胎鼠。置液氮中冷冻，再移至－70℃冰箱保存。所用器具必须经高温或用焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理，确保无RNA酶。 锌的研究 昆明种小鼠（体重25～30g ）由同济医科大学动物学部提供，数量、性别、饲养及分组同前。缺锌组：饲料含锌量仅为(3.0±0.5）mg?kg-1；补锌组；饲料中补锌量达30 mg?kg-1，在受孕第7天才给予补锌饲料；正常组：自始至终喂以正常饲料。动物须用去离子水。笼具、水瓶均用l％Na2EDTA侵泡处理，并定期用去离子水清洗。经25天锌耗竭性喂养后，按上法进行交配。受孕第12 天取样，并取胚胎作相应处理。 1.2血清维生素A的测定 采用荧光法（荧光分光光度计为日本日立公司生产的 F－3000型） 1.3股骨锌含量的测定 采用原子吸收分光光度法（北京第二光学仪器厂生产，WFX－1F2型) 1.4血清碱性磷酸酶（AKP）活性测定 采用北京中生生物工程技术公司生产的AKP试剂盒测定 1.5胎鼠 HOX 3.5基因mRNA的测定（原位杂交法） 胚胎组织总RNA的提取：随机取正常组受孕12 d胎鼠若干，利用TRIzol Total RNA提取试剂盒（美国GIBCO公司产品）提取总RNA。 探针的制备：根据从Internet网上基因库检索的HOXC4（3.5）基因的DNA序列，在H 3.5第一外显子区设计一对引物，长度为21个碱基，由GIBCO BRL公司合成。利用TitanTM 0ne Tube RT-PCR System（德国 Boehringer Mannheim公司产品）和上述合成的引物进行PCR扩增，获得cDNA片段作为DNA探针，长度为247bp。 按照地高辛DNA标记及检测试剂盒（Boehringer Mannheim公司产品）的方法，标记探针。 病理切片的制作：将鼠胎从－70℃取出后置于－20℃，在恒冷切片机上将鼠胎沿旁矢状切面切成6～8μm厚的切片（每只鼠胎切两张切片），迅速置于4％的多聚甲醛室温固定20min。PBS洗后，逐级酒精脱水。然后，－20℃保存备用。 原位杂交：用地高辛标记的探针与鼠胎切片进行原位杂交，探查HOXC4（3.5）的mRNA，并用酶联免疫显色（采用地高辛DNA标记及检测试剂盒）。具体操作步骤详见文献（3）。操作过程中，显色时间、条件保持一致，避免操作误差。 杂交结果的定量分析：采用HPLAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，对杂交点的阳性表达面积千分比（即面积密度（Area Density）=一个视野中阳性表达面积之和／一个视窗面积），及其平均光密度（L-Density）进行测定。该系统在测定过程中，可自动扣除背景干扰。 1.6统计处理 实验结果用平均数±标准差（?X±s）表示。组间用SAS统计分析软件进行方差分析。 2、结 果
由表1可知，受食物因素影响，维生素A缺乏组、补充组和正常组间血清维生素A水平逐步升高，并有显著差异（P<0.05）；其面积密度和积分光密度两个指标也呈相同规律。血清维生素A水平和面积密度、积分光密度呈正相关，相关系数见表4。
表3 不同锌营养水平母鼠的胎鼠HOX C4 (3.5）基因表达结果 （?X±s）
表4 母鼠Vit.A、Zn营养水平与HOX C4 (3.5）基因表达相关关系（r）
3、讨 论 同源异形盒基因（Homeobox gene）自1984年首次发现以来，已有了大量的研究报道。至今在鼠类和人类共发现了4簇同源异形盒序列，分别是HOX-A、HOX-B、HOX-C、HOX-D（4）。这些基因表达没有组织特异性，而只在胚胎发育过程中有各自不同的时间和空间特异性（5）。虽然对这类基因的结构、表达和调控的功能、机制有不少相关报道，但仍未到弄清的程度。在小鼠受孕第7天以后，胚胎正处于器官发生期，我们在研究中发现，此时母鼠维生素A和锌缺乏不仅可导致胎鼠畸变发生，而且也影响了HOX C4（3.5）的表达（6）。所以母乳体内的维生素A和锌的营养水平对相应的基因表达及胎儿的正常发育十分重要。 参考文献 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||